СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ
ВТМ - вирус табачной мозаики
ХВК - вирус X картофеля
Т - атом трития
М - молекула среды
RH - молекула углеводорода
Olefin - ненасыщенное органическое соединение
RX - производные углеводородов
R- радикал
Индексом * отмечены горячие частицы
HRP - изофермент С пероксидазы из корней хрена
ТОР - пероксидаза табака
АРХ - аскорбатпероксидаза
ARP - пероксидаза Arthromyces ramostis
ССР - цитохром с пероксидаза
CIP - пероксидаза Coprmus cinereus
PNP - пероксидаза арахиса
BP - пероксидаза ячменя
LIP - лигнинпероксидаза
МпР - марганец-пероксидаза
ВНА - бензгидроксамовая кислота
EDTA - этилендиаминтетрауксусная кислота
ABTS - 2,2’-азино-бис(3-этилбензтиазолин-6-сульфонат) аммония
RZ - отношение поглощений, AWA28O
Е - единица каталитической активности (цМ/мин)
РСА - рентгеноструктурный анализ ЯМР - ядерный магнитный резонанс
SDS-PAGE - электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия
ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.....................................................5
ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР................................................9
ГЛАВА I. ПЕРОКСИДАЗЫ : СТРУКТУРА И МЕХАНИЗМ КАТАЛИЗА... 9
1 1 Классификация пероксидаз и реакционный цикл 9
1 2 Структура пероксидаз и механизм расщепления перекиси водорода 10 13 Механизмы окисления донорных субстратов 13
1 4 Эффекторные свойства ионов металлов 15
ГЛАВА 2. МЕТОД РАДИАЦИОННОЙ ИНАКТИВАЦИИ ФЕРМЕНТОВ..18
ГЛАВА 3. МЕТОД ТРИТИЕВОЙ ПЛАНИГРАФИИ (ТЕРМИЧЕСКОЙ АКТИВАЦИИ ТРИТИЯ)................................................24
3 1 Основы метода 24
3 2 Горячие атомы 26
3 3 Анализ меченых препаратов 32
ГЛАВА 4. КОНФОРМАЦИОННЫЕ ПЕРЕХОДЫ В БЕЛКАХ.......................33
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 5. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ......................................42
5 1 Реагенты и коммерческие препараты ферментов 42
5 2 Препараты рекомбинантной пероксидазы хрена 42
5 2 1 Конструкция плазмид и мутантов 42
5 2 2 Получение препаратов рекомбинантной пероксидазы хрена 44
5 3 Методы, использованные в работе 49
3
возвращает протон на связанный с аргинином гидроксил, образующий молекулу воды (рис. 1). Перераспределение электронов приводит к образованию фермента с оксиферрил-гемом и л-катион-радикалом на порфириновом кольце, т.н. Соединения I. Участие дистальных остатков гистидина и аргинина в связывании и расщеплении перекиси водорода в активном центре пероксидазы хрена было подтверждено направленным мутагенезом этих остатков [12,13].
Молекула воды, обнаруженная в активном центре HRP и ее комплексах с феруловой кислотой и цианидом, также присутствует в кристаллических структурах других пероксидаз растений [14]. Остаток пролина, кислород которого образует водородную связь с молекулой воды активного центра, присутствует во всех пероксидазах суперсемейства растений Основываясь на кристаллических структурах вышеупомянутых комплексов HRP [14], авторы предложили механизм окисления субстратов с участием молекулы воды активного центра. Сначала Arg38 образует водородную связь с фенольным кислородом субстрата-восстановителя, что помогает переносу протона с фенольного кислорода на His42 посредством участия молекулы воды активного центра, удерживаемой в нужном положении водородной связью с кислородом Pro 139 Перенос электрона происходит на порфириновое кольцо гема При восстановлении Соединения II перенос протона, синхронный переносу электрона, может происходить через молекулу воды активного центра (рис. 2)
11
Arg384
His42V HN = C(NH2>2
І
/0
О
E + H202
Fe
з*
El + H20
Рис. 1 Участие дистальных остатков Arg и His в образовании молекулы воды
EI + S-»
His42*
Arg38*
I
HN = C(NH2b
I
I
—О
н—о
\
ч
Pro 139
Phe-R
EU + S
Рго139
Рис 2 Восстановление Соединений I (вверху) и И (внизу) фенольным субстратом, иллюстрирующее возможную роль молекулы воды активного центра
12
- Киев+380960830922