ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение............................................................... 5
Глава I, Современное состояние и перспективы использования полисахаридсодержащих препаратов в медицинской практике................. 11
1.1. Полисахариды и современные методы их анализа..................... 12
1.2. Применение стандартных образцов для анализа лекарственных препаратов растительного происхождения................................... 27
1.3. Применение полисахаридов в качестве лекарственных средств 34
Глава 2. Материалы и методы........................................... 45
2.1. Объекты исследования............................................. 45
2.2. Методы исследования.............................................. 45
2.2.1. Методы анализа лекарственного растительного сырья.............. 45
2.2.2. Получение экстрактов........................................... 49
2.2.3. Анализ экстрактов.............................................. 50
2.3. Методы химических исследований................................... 52
2.3.1. Выделение фракций полисахаридов................................ 52
2.3.2 Выделение полисахаридных фракций из экстракта листьев липы сердцевидной и сухого экстракта слоевищ цетрарии исландской........... 53
2.3.3. Количественное определение содержания полисахаридов в листьях липы сердцевидной и слоевищах цетрарии исландской..................... 56
2.3.4. Качественные реакции на полисахариды........................... 57
2.3.5. Количественное определение содержания уроновых кислот 58
2.3.6. Метод проведения гидролиза исследуемых образцов................ 59
2.3.7. Количественное определение редуцирующих сахаров методом Файербриджа, Уиллиса и Бута........................................... 59
2.3.8.Исследование полисахаридных фракций методом бумажной хроматографии.............................................................. 60
2.3.9.Исследование полисахаридных фракций методом газо-жидкостной хроматографии......................................................... 62
2.3.10. Исследование полисахаридных фракций методом высокоэффек-
2
N
тивиой жидкостной хроматографии.................................... 63
2.3.11. Испытание на чистоту выделенных фракций полисахаридов 63
2.4. Методы фармакологических исследований......................... 64
2.4.1. Определение острой токсичности полисахаридов................ 64
2.4.2. Оценка антигипоксической активности полисахаридов........... 65
2.4.3. Оценка противовоспалительных свойств фракций полисахаридов.... 67
2.5. Методы микробиологических исследований........................ 68
Глава 3. Изучение химического состава и фармакологической активности полисахаридных фракций липы сердцевидной листьев и цетрарии исландской слоевищ.................................. 69
3.1. Выделение и разделение полисахаридов из липы сердцевидной листьев и цетрарии исландской слоевищ................................. 69
3.2. Изучение химического состава полисахаридных фракций липы сердцевидной листьев и цетрарии исландской слоевищ.................. 71
3.2.1. Качественные реакции на полисахариды........................ 71
3.2.2. Изучение мономерного состава полисахаридных фракций липы
сердцевидной листьев и цетрарии исландской слоевищ................. 72
3.3. Изучение фармакологической активности полисахаридов листьев липы сердцевидной и слоевищ цетрарии исландской...................... 76
3.3.1. Изучение острой токсичности................................. 77
3.3.2. Изучение антитоксического действия.......................... 79
3.3.3. Изучение противовоспалительной активности................ 89
3.3.4. Изучение противомикробной активности полисахаридных фракций цетрарии исландской слоевищ..................................... 94
3.4. Изучение полисахаридных фракций методом высоко-эффективной жидкостной хроматографии........................................ 97
3.5. Изучение гемицеллюлоз с помощью ИК-спектроскопии.............. 98
3.6. Изучение ге.мицеллюлоз с помощью ЯМР-спсктроскопии......... 100
Глава 4. Разработка метода выделения, очистки и определение показателей качества стандартного образца полисахаридного состава 103
Наибольшее распространение имеют аналитические системы на основе комбинации капиллярного газового хроматографа и масс-спектрометра (Г'Х-МС). К сожалению, для анализа природных соединений этот метод имеет ограничения, так как необходимым условием является летучесть анализируемых веществ. Анализ менее летучих природных соединений, чем эфирные масла, затруднителен главным образом из-за малой доступности аналитических систем класса высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометра (ВЭЖХ-МС). Даже при наличии такой аппаратуры особенности масс-спектрометрической информации, обусловленные спецификой интерфейса жидкостной хроматограф-масс-спектрометр, не позволяют использовать существующие базы данных для идентификации разделенных компонентов. Для вводно-спиртовых экстрактов и настоек предлагается прием сравнения хроматографических профилей, не требующих идентификации компонентов. Этот метод имеет смысл использовать для контроля качества сырья и экстрактов, а также определения их подлинности. Вместе с тем ограничения ГХ-МС, связанные с низкой легучестыо большинства природных метаболитов, могут быть существенно уменьшены при использовании таких способов подготовки проб как в капиллярной ГХ, как предколоночное силилирование [208, 209]. Метод предколоночного силирования позволяет существенно понизить полярность соединений, содержащих гидроксильные, карбоксильные иаминогруппы, и тем самым делает их доступными для анализа методом ГХ-МС. Получение силиль-ных производных, например, для случая донора триметилсилильной (TMS) группы до и после взаимодействия с триметилсилильным агентом:
— ОН — СООН
— SH = NH
IMS
— О — Si(CH3)3 -> — COOSi(CH3)3 -> — S— Si(CH3)3 —>• = N — Si (СН3)з
Для успешного применения подобной предколоночиой модификации необходимо добиться полноты реакции силирования и отсутствия побочных процессов. Неоднократно показано, что спирты и кислоты достаточно легко и пол-
21
ностыо силилируются с образованием простых или сложных эфиров [261]. Редкие случаи образования артефактов специально описаны [255]. Специфика при силировании углеводов, обусловленная образованием таутомерных форм сахаров при растворении исследуемого образца в пиридине, тоже хорошо изучена (240, 254, 265]. Все таутомерные формы углеводов силируются и выходят на хроматограмме отдельными пиками, например, теоретически возможно наблюдать па хроматограмме в случае глюкозы все 5 форм (2 пиранозные, 2 фураноз-ные и альдольную форму). Однако практически в пиридиновом растворе равновесие сдвинуто в сторону образования пиранозных форм, и на хроматограмме мы получим только пики пентацис-[триметилсилил]-глюкопирнозы. Чтобы избежать таутомеризации углеводов и, как следствия, появления на хроматограмме нескольких пиков одного и того же углевода, некоторые авторы предлагают обрабатывать экстракты гидрохлоридом гидроксиламина (для связывания альдегидной труппы) [248]. Для количественной интерпретации содержания углеводов можно просто суммировать площади пиков различных форм аномеров углеводов [209].
В настоящее время для количественного определения содержания полисахаридов в растительном сырье используются различные методы, основанные либо на проведении предварительного гидролиза полисахаридов, либо без него. Методы, требующие предварительного гидролиза, основаны на использовании восстанавливающих свойств моносахаров. Определение образовавшихся в процессе гидролиза полисахаров проводят или с использованием титриметри-ческих методов анализа, или физико-химических. При фотометрическом определении содержания полисахаридов используется их способность восстанавливать в щелочной среде пикриновую кислоту до пикрамовой [17, 22, 23, 25, 62, 81, 100, 106, 145, 172, 174, 183,215,216,222].
Также широко используется спектрофотометрическаи .методика количественного определения полисахаридов, основанная на их способности взаимодействовать с ароматическими фенолами (фенолом, антроном, резорцином) в присутствии концентрированной серной кислоты [I, 16, 22, 29, 30, 32,
22
- Киев+380960830922