РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Експерименти були виконані на 720 нелінійних мишах масою 18,0-20,0 г, 365 нелінійних щурах масою 180,0-220,0 г.
Усі маніпуляції, які можуть спричиняти біль, були проведені під етамінал-натрієвим наркозом (40 мг/кг) внутрішньоочеревинно [51]. Досліди здійснювали згідно з "Правилами проведення робіт з використанням експериментальних тварин" (Страсбург,18.03.86), Наказ МОЗ УССР №32 від 22.02.88.
Скринінгові дослідження
Об'єктом дослідження були 23 речовини: ефіри та аміди - нові похідні 2-оксоіндолін-3-гліоксилової кислоти, синтезовані на кафедрі аналітичної хімії Національного фармацевтичного університету під керівництвом завідувача кафедрою, доктора хімічних наук, професора В.В. Болотова. Структурна формула ефірів (І) та амідів (ІІ)
2-оксоіндолін-3-гліоксилова кислота
(I)
(II)
Гостру токсичність похідних 2-оксоіндолін-3-гліоксилової кислоти вивчали на білих нелінійних мишах різної статі масою 20±2г при внутрішньоочеревинному введенні в обсязі 1мл одноразов. Речовини вводили у вигляді водних розчинів чи тонкодисперсної водяної суспензії, стабілізованої твіном-80. Кожну дозу досліджували на 6 тваринах, при цьому тривалість спостережень за станом мишей складала 5 днів [51].
Розрахунок середньосмертельної дози проводили за методом Кербера [119]:
(2.1),
де LD100 - кількість речовини, яка викликала певний ефект у 100%
стандартної групи піддослідних тварин протягом
терміну спостереження;
d - інтервал між кожними двома суміжними дозами;
z - середнє арифметичне з числа тварин, у яких спостерігалась
реакція, що досліджувалася, під впливом кожних двох суміжних доз;
S(zd) - сума середньоарифметичних чисел;
n - кількість піддослідних тварин у кожній групі.
Підставляли у формулу (2.1) значення та графічно виражали "доза-ефект", з якого визначали відносну стандартну помилку LD50 за формулою Геддама (2.2, 2.3). З графіка находили LD84, і LD16.
, (2.2).
Потім знаходили середню помилку середньосмертельної дози (довірчі границі), використовуючи формулу Геддама:
, (2.3),
де К - коефіцієнт 0,564;
d - інтервал між кожними двома суміжними дозами;
n - число тварин у групах.
Оцінку токсичності проводили за загальноприйнятою класифікацією К.К.Сидорова (1973) [121].
Середньосмертельну дозу аміда вивчали на двох видах тварин - білих нелінійних мишах масою 20±2г і білих нелінійних щурах масою 190±10г різної статі при внутрішньоочеревинному і внутрішньошлунковому шляхах уведення у вигляді водного розчину чи тонкодисперсної водяної суспензії, стабілізованої твіном-80. Кожну дозу досліджували на шести тваринах, при цьому тривалість спостережень за станом мишей складала 5 днів, а за станом щурів 14 днів ?51]. Розрахунок гострої токсичності проводили за методом Кербера (формули 2.1, 2.2, 2.3) [119], враховуючи дози, які викликали 0 і 100%-вий ефект. Оцінку токсичності проводили за загальноприйнятою класифікацією К.К.Сидорова (1973) [121].
Для характеристики широти терапевтичної дії аміду і препарату порівняння мексидолу ми визначали середньосмертельну дозу також у мексидолу при тих же шляхах уведення препарату.
Антигіпоксичну активність похідних 2-оксоіндолін-3-гліоксилової кислоти досліджували відповідно до "Методические рекомендации по доклиническому исследованию антигипоксических средств" [88] при моделюванні гострої гіпоксичної гіпоксії, яку відтворювали, розміщуючи тварин у гермокамері обсягом 200мл. Досліди проводили на попередньо відібраних стійких до гіпоксії білих нелінійних мишах-самцях масою 20±2г. За референс-препарат в даних та подальших дослідженнях ми використовували мексидол, який широко відомий в медичній практиці як антигіпоксант.
Препарат порівняння мексидол в ЕД50 = 100мг/кг та досліджувані речовини в дозі 1/10 їх LD50 вводили у вигляді водного розчину чи тонкодисперсної водної суспензії, стабілізованої твіном-80 внутрішньоочеревинно одноразово за 30 хвилин до початку експерименту. Дію кожної речовини вивчали на 6 тваринах ?79?. Контрольна група аналогічним шляхом отримували ізотонічний розчин натрію хлориду і твін-80. Антигіпоксичну активність оцінювали за тривалістю життя тварин дослідної групи у порівнянні з контролем та дією еталонного препарату.
Для оцінки антиоксидантної дії оксоіндоліну визначали вміст ТБК-активних продуктів ПОЛ (МДА), які розраховували за формулою в нмоль/мг білка = (Д535 нмоль/мг білка 1,56) 10000. 1,56 10-5 - коефіцієнт молярної екстинції МДА. Швидкість накопичення МДА (нмоль/мг білка *хв) = вміст МДА (нмоль/мг білка)/час інкубації (хв). За даними літератури відомо два класи аналітичних методів: прямі методи, у яких аналізується МДА сам по собі, та непрямі методи оцінки продуктів реакції МДА з іншими сполуками, які мають флуоресценцію, поглинання та інші властивості, які можна реєструвати.
Прямі методи мають свої особливості та технічні труднощі, пов'язані з коректною підготовкою проб, необхідністю постійного застосування свіжих стандартів, наявністю спеціального обладнання. Все це обмежує їх практичне застосування.
Із непрямих методів найбільш розповсюдженим є метод з ТБК. Принцип методу - визначення інтенсивності забарвлення, яке утворюється в ході реакції між МДА і ТБК, що протікає в кислому середовищі та при високій температурі. Триметиновий комплекс, який утворюється в результаті реакції, містить одну молекулу МДА та дві молекули ТБК, має характерний спектр поглинання з максимумом при ?=535 нм. Реактиви, які використовуються: 1) розчин ортофосфорної кислоти, 2%, рН 1,3; 2) розчин ТБК, 0,8%; 3) н-бутанол. Визначення активності МДА проводили наступним чином. До 0,2 мл сироватки крові та супернатанту нирки додавали 3 мл розчину ортофосфорної кислоти та 1 мл розчину ТБК. Проби витримували протягом 45 хв при температурі 1000 С. По