РАЗДЕЛ 2
ВЫБОР НАПРАВЛЕНИЯ И МЕТОДИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ
ИССЛЕДОВАНИЯ
Для решения поставленных в работе задач было обследовано 204 больных
эпилепсией, находившихся на лечении в отделениях Института неврологии,
психиатрии и наркологии АМН Украины и в Городской клинической больнице №15
г.Харькова. Контрольную группу составили 74 практически здоровых лица обоих
полов в возрасте от 20 до 60 лет с неотягощенной в плане эпилепсии
наследственностью. Среди обследованных больных было 95 женщин и 109 мужчин в
возрасте от 20 до 60 лет с давностью заболевания эпилепсией не менее трех лет.
Клиническая форма заболевания определялась типом эпилептических припадков по
международным классификациям 1981 и 1989 гг. [268, 1].
Методика обследования включала тщательный анализ жалоб, анамнестических данных,
данных неврологического и соматического статусов, электроэнцефалографические
исследования, томографические (компьютерная томография головного мозга,
ядерно-магнитно-резонансная томография головного мозга) исследования,
определение биохимических показателей состояния процессов перекисного окисления
липидов, антиоксидантной системы, содержания жирных кислот, а также
исследования аминокислотного спектра сыворотки крови у изученных больных.
При поступления больных в стационар анализировались предъявляемые жалобы
(характер и структура приступов, их частота, субъективные ощущения во
внеприступном периоде и др.), анамнестические данные (связь этого заболевания с
экзогенными воздействиями – травмами, инфекциями, интоксикациями и др.,
наследственная отягощенность, возраст, когда возникли первые эпилептические
пароксизмы, срок возникновения припадков после предполагаемого экзогенного
воздействия, эволюция эпилептических проявлений с течением заболевания,
получаемое антиэпилептическое лечение и его эффективность, социальная адаптация
больных и др.). У больных исследовался неврологический статус и оценивалась
сопутствующая соматическая патология в день поступления и в дальнейшем
регулярно в течении срока пребывания в стационаре. С целью верификации диагноза
проводилось электрофизиологическое исследование (электроэнцефалография) в
первые три дня нахождения больного в стационаре. Для уточнения состояния тканей
головного мозга и ликворосодержащих пространств использовали томографические
методы исследования.
В работе использовались методы, позволяющие регистрировать промежуточные
(диеновые конъюгаты) и конечные (малоновый диальдегид) продукты перекисного
окисления липидов.
Исследования проводились в сыворотке крови обследованных больных эпилепсией.
В качестве промежуточного продукта ПОЛ нами определялись диеновые конъюгаты –
молекулы жирных кислот, содержащие двойные связи. Именно эти соединения
позволяют судить о скорости перекисного окисления липидов в органах и тканях. В
биологических объектах окислению подвергаются преимущественно полиненасыщенные
жирные кислоты, и обнаружение диеновой конъюгации может быть чувствительным
тестом на появление гидроперекисей, среди которых диеновые конъюгаты неизбежно
будут образовываться в определенном процентном соотношении. Поскольку диеновая
конъюгация появляется в сущности на стадии образования свободных радикалов, то
ее наличие в продуктах ПОЛ говорит об образовании продуктов из свободных
радикалов, а следовательно подтверждает свободнорадикальный механизм
перекисного окисления липидов. Отношение числа молекул гидроперекисей к
диеновым конъюгатам в биологических объектах составляет 1 : 2. Дальнейшее
окисление гидроперекисей и диеновых конъюгатов приводит к образованию таких
соединений как спирты, кетоны, альдегиды, диальдегиды, эпоксиды, полимеры и
т.д. Конечным продуктом окисления гидроперекисей жирных кислот является
малоновый диальдегид.
Определение диеновых конъюгатов в сыворотке крови и мочи осуществлялось по
Плацеру (Ю.А.Владимиров, А.И.Арчаков, 1972) [33] следующим образом: к 1 мл
сыворотки добавляли 4 мл смеси изопропиловый спирт – гептан, в соотношении
объем /объем 1/1. Смесь центрифугировали в течение 5 минут при 5000 об/мин.
Надосадочную жидкость переносили в градуированные пробирки, встряхивали, ждали
расслаивания фаз. Отбирали 1,0 гептанового (нижнего) слоя, высушивали в
вакуум-эксикаторе в течение одного часа. Затем к остатку добавляли 3,0 мл
метанола и замеряли оптическую плотность при 233 нм на СФ-46. В качестве
контроля использовали пробы, не содержащие биологического материала.
Сопряженные диены обладают молярным коэффициентом экстинкции при 233-234 нм.
Е = 2,1 – 2,3 ? 10 5 М -1 ? см -1
Содержание диенов определяли в нмоль/л, используя молярный коэффициент
экстинции.
Определение малонового диальдегида.
Среди конечных продуктов перекисного окисления липидов удается обнаружить около
18 альдегидов и кетонов (Ю.А. Владимиров, А.И.Арчаков, 1972) [33]. Все они
являются результатом одноступенчатого окисления. Однако МДА по цветной реакции
с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) до сих пор остается одним из главных методов
изучения свободнорадикального перекисного окисления липидов в биологических
системах.
В основе метода лежит реакция между МДА и тиобарбитуровой кислотой, которая при
высокой температуре и кислом значении рН протекает с образованием окрашенного
триметинового комплекса, содержащего одну молекулу МДА и две молекулы
тиобарбитуровой кислоты. Максимум поглощения комплекса приходится на 532 нм.
Ход исследования заключается в следующем: инкубационную среду, содержащую 50 мМ
трис-HCl буфер (рН 7,4) и сыворотку крови 2,0 помещали в водяную баню (t