РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Матеріали
2.1.1. Клітинні лінії та штами бактерій
В роботі було використано наступні трансформовані лінії клітин людини: M-HeLa
(карцинома шийки матки людини), KB (епідермоїдна карцинома слизової оболонки
ротової порожнини людини), A 431 (епідермоїдна карцинома вульви людини) та
MCF-7 (фіброцистома молочної залози).
Для визначення антимікробної активності рекомбінатного бета-дефенсина-2
використовували культуру бактерій Bacillus subtilis ATSS 6633. Бактеріальна
культура отримана з Української колекції мікроорганізмів ІМВ НАНУ (Київ,
Україна).
2.1.2.Культивування клітинних ліній
Клітинні лінії вирощували при 370С у середовищах DMEM або RPMI-1640, що містили
5-10% сироватки ембріонів телят (Gibco BRL, Великобританія), в атмосфері 5%
СО2. Для культивування використовувались пластикові флакони, та планшети (Nunc,
Данія; Costar, США; Greiner, Німеччина), а також скляні чашки Петрі (Anumbra,
Німеччина).
2.1.3. Соматична гібридизація
Отримання гібридних клітин, що продукують антитіла проти hBD-2 людини,
проводили згідно протоколу “Antibodies. A Laboratory Manual” [146]. Імунізацію
мишей лінії BALB/c віком 3-4 місяці проводили GST-hBD-2 злитим білком, в якому
цитотоксична активність hBD-2 редукована, інтраперитоніально за слідуючою
схемою: перша імунізація – 100 мкг злитого білка в 100 мкл буфера РBS,
розведеного 1:1(v/v) повним ад’ювантом Фрейда; друга – через місяць ін’єкцією
50 мкг антигену в PBS та рівного об’єму неповного ад’юванта Фрейнда, третя та
четверта – ідентично другій. Для контролю імунної відповіді кров відбирали з
хвостової вени через 5 днів після останньої імунізації. Методом
імуноферментного аналізу було встановлено, що титр антитіл становив 10-5.
Імунну відповідь підсилили ін’єкцією 50 мкг антигену в 100 мкл фізіологічного
розчину. Через 3 – 4 дні проводили соматичну гібридизацію спленоцитів
імунізованих тварин з клітинами мієломи миші SP2/0.
2.1.4. Клінічний матеріал
В експериментах по дослідженню експресії гена hBD-2 та продукції даного пептида
клітинами пухлин було використано зразки тканин хірургічно видалених пухлин
шлунка та умовно-нормального епітелія тих же пацієнтів, що оточував пухлину та
також видалявся під час операції (Табл. 2.1).
Пухлинний матеріал людини, а також зразки нетрансформованого епітелію шлунка
було отримано з відділів торакальної хірургії (зав. відділом проф. Ганул В.Л.)
Інституту онкології АМН України. Було сформовано масив досліджуваних тканин
пухлин шлунка різної локалізації (верхня, середня та нижня третина). Всі
пухлини були 2, 3 та 4 стадії з різним ступенем диференціювання.
Гістопрепарати трансформованого та нормального епітелія шийки матки було
люб`язно надано морфологічною лабораторією „Біонтек” (м. Дніпропетровськ).
Таблиця 2.1
Характеристики пухлин шлунку, що було досліджено в експериментах
№ п/п
стать
вік
Гістологічний тип пухлин
Стадія диференціювання
TNM
Ж
65
AК
G4
T4N2M0
59
AК
G3
T3N2M0
65
ЗР
G3
T3N0M0
71
AК
G4
T3N2M0
80
ЗР
G2
T3N1M0
65
ЗР
G2
T3N0M0
68
AК
G3
T3NxM0
69
AК
G4
T3N2M0
67
AК
G2
T2N1M0
10
63
AК
G3
T4N0M0
11
54
ЗР
G4
T3N1M0
12
57
AК
G4
T3N2M0
13
45
AК
G3
T4N0M0
14
69
AК
G4
T2N0M0
15
55
AК
G3
T4N0M0
16
52
AК
G2
T4N2M1
17
65
AК
G2
T4N1M0
AК – аденокарцинома, ЗР – залозистий рак, G2 – пухлини середнього ступеня
диференціювання, G3 – низькодиференційовані пухлини, G4 – недиференційовані
пухлини.
2.2. Біохімічні методи.
2.2.1. Афінна хроматографія
Першою стадією очистки GST-hBD-2 злитого білка з лізату бактеріальної культури
була афінна хроматографія з використанням колонки 5ml GSTrap (№17-5131-01,
Amersham Biosciences), що містила GST-сефарозу в якості носія [147]. Очистку
проводили з використанням хроматографічної системи ActaPrime (Amersham
Biosciences, Велика Британія). Зібрані центрифугуванням клітини індукованої
культури руйнували сонікацією (44 кГц, 5 разів по 30 с) в буфері (50 мМ
Tris-HCl, pH 7,6; 250 мМ NaCl; 5 мM DTT) на ультразвуковому дезінтеграторі
(UD-11 automatic, Польща). Лізат освітлювали центрифугуванням при 17000g на
центрифузі типу еппендорф (Eppendorf 5415С, США) та наносили на вищевказану
афінну колонку зі швидкістю протоку 2 мл/хв. Після нанесення зразку, колонку
промивали 20 об’ємами того ж буфера та елюювали зв’язаний злитий білок тим же
буфером, що містив 20 мМ глутатіону.
2.2.2. Гель фільтрація
Однією з стадій очистки активного бета-дефенсина-2 був метод гель-фільтрації
[148]. В роботі була використана таж хроматографічна система, що й у випадку
афінної хроматографії. Для проведення гельфільтрації було застосовано колонку
Superose 10/300 (№17-5172-01, Amersham Biosciences, США). Хроматографію
проводили при швидкості протоку 0,7 мл/хв в буфері 20мМ Tris-HCl, pH 7,6; 20 мМ
NaCl, 5 мМ в-меркаптоетанола в присутності або за відсутності 4М сечовини.
2.2.3. Зворотньофазова хроматографія
Для очищення препарату рекомбінантного бета-дефенсина-2 людини від сечовини
після стадії гельфільтрації в роботі було використано метод зворотньофазової
хроматографії. Для цього було використано картридж Sep-Pak C18 (Waters, США).
Хроматографію проводили згідно протоколу виробника [149].
2.2.4. Електрофорез білків
Електрофорез білків з додецилсульфатом натрію проводили в вертикальних
пластинах в системі буферів Леммлі [150] в 7-22% градієнтних поліакриламідних
мінігелях товщиною 1 мм, використовуючи електрофоретичний прилад SE200 (Hoefer
Scientific Instruments). Електрофорез вели при постійному струмі (в
концентруючому гелі - 15 мА,
- Київ+380960830922