Розділ 2
Матеріали і методи досліджень
2.1. Матеріали і обладнання
В роботі використовували: центрифуги MSE High Speed 18” Bеckman L-5, Eppendorf
544R”, Eppendorf 5804, Eppendorf 5417R, pH метр“Hanna 8521” прилад для
напівсухого перенесення Trans Blot SD “Bio Rad” (США), джерело струму Stuart
Scientific SI50, ампліфікатор Eppendorf, хроматограф AKTA FPLC Amersham,
качалка Stuart, термостат, мікроскоп Leika, денситометр Anthos 2001.
Для досліджень були використані чотири препарати раку щитовидної залози людини
та препарат меланоми шкіри людини, а також аліквоти сироваток крові тих самих
хворих фрагменти пухли від яких було використано для створення кДНК бібіліотек,
та інших онкологічних хворих і практично здорових донорів. Для створення кДНК
експресуючих бібліотек використовували набір реактивів фірми Stratagene (США)
та Clontech (США) та пакувальні екстракти Gigapack III Gold - Stratagene (США).
Для репродукції фага l використовували клітини E.coli XL-1 Blue MRF`. Для
перенесення рекомбінантної вставки з фагміди до плазміди використовували
клітини SOLR, для клонувань та експресії штами XL-Gold, BLDE3LysS. Для
вирощування бактерій та фагів використовували поживні середовища (LB, 2YT,
NZY), агар та агарозу фірми Difco (США). Ферменти для клонувань (рестриктази,
полімерази, лігази) використовували фірм Fermentas (Литва), Stranagene (США),
Clontech (США).
Використовували інгібітори протеаз, натрій додецил сульфат, персульфат амонію
Bio-Rad, акриламід, бісакриламід, Tween ”Sigma” (США), TEMED, DMSO, DDT ”Serva”
(Німеччина). Користували HCl, H2SO4, NaOH, KOH, CH3COOH NaCl, KCl, NaH2PO4,
Na2HPO4, MgCl2 C2H5OH вітчизняного виробництва, кваліфікації о.с.ч.
2.2. Одержання препаратів сумарної РНК з пухлин щитовидної залози та меланоми
Сумарну РНК виділяли з 300-400 мг свіжозамороженої тканини злоякісної пухлини
щитовидної залози або меланоми за допомогою модифікованого
гуанідин-ізотіоціанатного метода [115]. Тканину гомогенізували у 1 мл розчина
D, який містив 4 М гуанідин-ізотіоціанат, 25 мМ цитрата натрію, 0,5 % саркозилу
та 0,1 М 2-меркаптоетанолу. Після гомогенізації додавали 0,1 мл ацетату натрію
(рН 4,0), 1 мл водонасиченого фенолу та 0,2 мл суміші хлороформ-ізоаміловий
спирт (49:1), центрифугували та відбирали водну фазу, що містить РНК. РНК
осаджували додаванням 0,9 об’єму ізопропанолу та центрифугуванням. Осад
розчиняли у буфері D і знову осаджували ізопропанолом, осад промивали 75 %
етанолом та розчиняли у воді з додаванням 1 мкл RNAsinе (інгібітор РНКаз).
2.3. Виділення мРНК з препаратів сумарної РНК
мРНК очищали за допомогою афінної хроматографії на oligo (dT) носії Dynabeds
(Dynal, Велика Британія). Для цього 150 мкг сумарної РНК розчиняли у
високо-сольовому буфері та зв`язували з носієм. Після промивання
середньо-сольовим буфером мРНК елювали водою. Аналіз якості очищених препаратів
мРНК оцінювали за допомогою спектрофотометрії і електрофореза у 1%
формальдегід-агарозному гелі. Очищені препарати мРНК до їх використання
зберігали під етанолом при -800С [116].
2.4. Синтез кДНК бібліотек
кДНК бібліотеки предстівляють інформацію, яка закодована у мРНК певної тканини
чи організму. Оскільки молекули РНК дуже лабільні і їх важко ампліфікувати. Для
досліджень послідовність, яку вони кодують, конвертують в стабільну
дволанцюгову ДНК, після чого її інтегрують до л вектора, який здатний до
самореплікації. Після створення кДНК бібліотеки виділення та характеристика
окремих сегментів генетичної інформації стає відносно простим завданням. В
ZAP-cDNA® synthesis kit використовується лінкер-праймер, який містить oligo(dT)
послідовність та сайт для Xho I рестриктази. У видаку лTriplEx Libraries kit
лінкер містить сайт для Xba I.
Для ситнезу першої нитки ДНК використовують мРНК як матрицю, лінкер-праймер,
5-метил дезокси-урацил та ревертазу StrataScript. Введення метильних залишків в
першу нитку ДНК, при використанні 5-метил-дезокси-урацила, зберігає кДНК від
рестрикції певними рестриказами, зокрема Xho I. Тому при інкубації з Xho I
тільки неметильований сайт всередині лінкер-праймера піддається рестрикції.
Напівметильовану ДНК трансфекують у McrA- McrB- штами (такі як XL1-Blue MRFґ)
для запобігання знищення клітинними рестриктазами. Після пасажу бібліотеки
через XL1-Blue MRFґ клітини ДНК втрачає метильні залишки і її можна
трансфекувати в McrA+ McrB+ штами типу XL1-Blue. Всі процедури по створенню
кДНК проведено згідно протоколів ZAP-cDNA® synthesis kit Stratagene (CША)
[117].
2.5. Підготовка і лігування кДНК у фагміду
В роботі використовували експресуючи вектори TriplEx або UniZap. На відміну від
UniZap вектора, який здатний генерувати поліпептидний ланцюг тільки в одній
рамці зчитування. TriplEx, здатний експресувати послідовність в 3 рамках, що
суттєво підвищує шанси ідентифікації позитивних бляшок. В залежності від
вектора використовували адаптори з різними сайтами рестрикції, для TriplEx
EcoRI та XbaI, для UniZap EcoRI та XhoI. Спочатку до кДНК додавали адаптори для
EcoRI, 1 мкл лігазного буферу, 1 мкл 10мМ АТФ та 4 од. Т4 лігази та інкубували
протягом ночі при 8оС. Лігазу інактивували прогрівом при 70оС протягом 30
хвилин. Після цього проводили фосфорилювання кінців адапторів за допомогою
полінуклеотидкінази при 37оС протягом 30 хвилин. Одержаний препарат ДНК
перетравлювали рестриктазою XhoI для лігування у вектор UniZap або рестриктазою
XbaI для лігування у вектор TriplEx. Одержаний продукт очищували за допомогою
електрофорезу у 1 % агарозному гелі та елюювали зону, яка містила фрагменти ДНК
розміром від 0,5 до 3 кВ для подальшої р
- Київ+380960830922