РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Одержання ферментів та білків.
2.1.1. Одержання Глу- та Ліз-плазміногену.
Глу-плазміноген людини виділяли із свіжоотриманої цитратної плазми донорської крові за допомогою афінної хроматографії на лізин-сефарозі [93] в присутності контрикалу (10 мг/мл) на холоду. Глу-плзміноген елюювали 0,1 М 6-АГК, осаджували (NH4)2SO4 - 0,33 г/мл, центрифугували, осад розчиняли в 0,01 М трис-HCl буфері, рН 9,1, що містив 0,1 мМ ЕДТО, 10 мМ лізин. Розчин Глу-плазміногену обробляли протягом 2 год 10 мМ ДФФ при кімнатній температурі для інактивації ймовірної спонтанної активності домішку плазміну з наступною гель-фільтрацією на колонці з сефадексом G-150, врівноваженій 0,1 М (NH4)НСО3.
Одержані препарати Глу-плазміногену мали потенційну казеїнолітичну активність 15-25 к.о. на 1 мг білка і були електрофоретично гомогенні в 11,5 % ПААГ за рН 3,2 (рис. 2.1). Глу-плазміноген зберігали у вигляді ліофілізованого порошку при 4 оС або в замороженому стані при -20 оС.
Ліз-плазміноген виділяли з фракції донорської крові ІІІ2,3 за Коном подібно Глу-плазміногену на лізин-сефарозі без додавання інгібітора. Домішки Глу-форми відокремлювали іонообмінною хроматографією на DEAE-сефадексі А-50 [9] з наступним концентруванням на ультрафільтраційній установці або перетворювали на Ліз-форму, обробляючи плазміном при ваговому співвідношенні фермент:субстрат - 1:50 протягом 30 хв при кімнатній температурі з наступним інгібуванням ферменту п-НФГБ та ДФФ (кінцеві концентрації становили 10-4 та 10-2 М відповідно). В обох випадках препарати Ліз-плазміногену гель-фільтрували на колонці з сефадексом G-150, врівноваженій 0,1 М (NH4)НСО3 або 0,05 М Na-фосфатним буфером, рН 7,4, ліофілізували або заморожували і зберігали при 4 оС або при -20 оС відповідно.
Потенційна питома активність Ліз-плазміногену становила 15-20 к.о. на 1 мг білка. Електрофоретично в ПААГ за рН 3,2 препарати були гомогенними (рис. 2.1).
2.1.2. Виділення фрагментів плазміногену.
Для одержання кринглів 1-3, 4 та міні-плазміногену проводили гідроліз Глу- або Ліз- плазміногену (10 мг/мл) панкреатичною еластазою свині за вагового співвідношення еластаза : плазміноген 1:50 в 0,05 М трис-HCl буфері, рН 8,5, що містив 0,1 М NaCl, протягом 5 год при 25 оС [14]. Реакцію зупиняли додаванням п-НФГБ до кінцевої концентрації 0,01 М. Проводили гель-хроматографію гідролізату на сефадексі G-75 для відокремлення кринглу 4 від міні-плазміногену і кринглів 1-3, останні розділяли наступною хроматографією на лізин-сефарозі. Виділені фрагменти ліофілізували або заморожували і зберігали при 4 оС або при -20 оС відповідно. Потенційна питома активність міні-плазміногену становила 30-40 к.о. на 1 мг білка. Електрофоретично в ПААГ з DS-Na фрагменти були гомогенними (рис. 2.2).
Для одержання мікро-плазміногену проводили гідроліз Глу- або Ліз-форм проферменту плазміном за вагового співвідношення ферменту до плазміногену 1:10 в 0,1 М гліцин-HCl буфері, рН 10,5 протягом 24 год при 25 оС. Гідролізат послідовно пропускали через колонки з лізин-сефарозою та соєвий інгібітор трипсину-сефарозою, після чого наносили на колонку mono Q. Білок елюювали за градієнтом рН 9,3-7,1 [61]. Мікро-плазміноген зберігали при -20 оС протягом 6 місяців. Потенційна питома активність мікро-плазміногену становила 40-50 к.о. на 1 мг білка. Електрофоретично в ПААГ з DS-Na фрагмент був гомогенним (рис. 2.2).
2.1.3. Одержання плазміну, міні- та мікро-плазміну.
Плазмін, міні- та мікро-плазмін отримували активацією відповідних проферментів стрептокіназою в співвідношенні 25 МО на 1 к.о. профермента протягом 2 год при кімнатній температурі в трис-лізиновому буфері, рН 9,0 з 25 % гліцерином і зберігали в 50 % гліцерині при -10 оС.
Коли домішок стрептокінази був небажаним, плазмін, міні- та мікро-плазмін одержували активацією відповідних проферментів урокіназою [173], що іммобілізована на активованій бромціаном сефарозі. 1 мг проферменту інкубували з 0,5 мл гелю урокіназ-сефарози (1250 МО/мл) протягом 1 год при 37 оС в 0,05 М натрій фосфатному буфері, рН 7,4, з 25 % гліцерином. Препарати зберігали в 0,05 М натрій фосфатному буфері, рН 7,4, з 50 % гліцерином при -10 оС.
За умов активації ступінь перетворення проферменту в фермент складає не менш 95 %.
Ефективність активації оцінювали за казеїнолітичною або амідолітичною активністю та даними електрофорезу в ПААГ з DS-Na за присутності 2 % ?-меркаптоетанолу.
2.1.4. Одержання фібриногену.
Фібриноген одержували з оксалатної плазми крові бика у присутності соєвого інгібітора трипсину шляхом висолювання сульфатом натрію [336]. Фібриноген звільняли від домішок плазміногену, обробляючи розчином лізину з наступним спиртовим переосадженням білка [378], чи афінною хроматографією на Ліз-сефарозі. Вміст фібриногену, що зсідається під дією тромбіну, становиить 95-98 %. Електрофоретично в 7,5 % ПААГ з DS-Na фібриноген був гомогенним.
2.1.5. Одержання des AABB-фібрину.
des AABB-фібрин одержували активацією фібриногену (2,5 мг/мл) тромбіном (1 од. NIH/1 мг фібриногену) в 0,05 М натрій фосфатному буфері, рН 7,4, протягом 4 год при 37 оС [379]. Для інактивації ф XIII a фібрин утворювали в присутності п-хлормеркурійбензоату натрію (0,35 мг/мл реакціонної суміші). Для видалення домішок плазміногену в реакційне середовище вносили 0,05М 6-АГК. Згусток, що утворювався, розчиняли в 0,125 % оцтовій кислоті при 0 оС, двічі переосаджували - спочатку в 0,06 М калій фосфатному буфері, рН 6,05, після чого - в 0,05 М натрій фосфатному буфері, рН 7,4, що містив 0,13 М NaCl. Препарат фібрин-мономера розчиняли в 0,125 % оцтовій кислоті до концентрації 1,5-2,0 % і зберігали при 0 оС. Згустки, що утворювали з одержаного фібрин-мономера, не прошивались (рис. 2.3) і не гідролізувались 5,0 МО тканинного активатора/мг б