Содержание
Введение. 4
Глава 1. Литературный обзор. S-цснтрированнмс радикалы и 7 нуклеофилы in vivo и in vitro.
§1.1. Короткоживущие реакционные радикалы и интермедиаты в 7 биологии.
Краткая историческая справка. 7
О-, С- и S- центрированные радикалы in vivo. 11
§1.2. SH-соединения и сульфиты. 16
Тиолы и SH-содержащие белки. 16
* Сульфиты. 20
Ox-Red статус. 22
Методы регистрации тиолов. 25
§ 1.3. Метод спиновых ловушек. 29
Суть метода. 29
Применение метода спиновых ловушек для регистрации 30 короткоживущнх радикалов in vivo.
Фармакологические свойства спиновых ловушек. 37
Артефакты в методе спиновых ловушек. 38
Окисление примесей в спиновых ловушках 38
Обратный спиновый захват 40
щ Механизм Форрестера-Хэпбурна. 43
Реакция циклоприсоединения. 45
Реакции с участием ионов переходных металлов. 46
Механизмы гибели радикальных аддуктов. 48
§1.4. Метод ЯМР спиновых ловушек. 49
Глава 2. Исследование механизма реакции S-центрированных 54 нуклеофилов с нитронными спиновыми ловушками.
§2.1. Результаты. 55
Исследование механизма реакции ДЭФМПО с сульфитом. 55
Исследование механизма реакции ДМПО с сульфитом. 60
ф Исследование механизма реакции спиновых ловушек с тиолами. 63
§2.2. Обсуждение полученных результатов. 64
Обсуждение результатов исследования механизма реакции 64 ДЭФМПО с сульфитом.
Продукты и механизм реакции. 64
Описание кинетических зависимостей образования Р/ и Р> в 68 реакции сульфита с ДЭФМПО Обсуждение результатов исследования механизма реакции 71 ДМПО с сульфитом.
Продукты и механизм реакции. 71
Анализ температурной зависимости. 73
Определение вклада механизма Форрестера -Хэпбурна в 74
• 1
формирование радикального аддукта ДМПО и сульфитного радикала.
Обсуждение результатов исследования механизма реакции 75
спиновых ловушек с тиолами.
§2.3. Обобщение результатов по первой главе. 76
Глава 3. Исследование механизма гибели радикальных аддуктов 8- 80 центрированных радикалов с нитронными спиновыми ловушками.
§3.1 Результаты. 81
Детектирование продуктов реакции спиновых ловушек с 81 тиильными радикалами методами ЭПР и ЯМР 11 Р.
Исследование механизма гибели радикальных аддуктов 83 нитронных спиновых ловушек с глутатионовым радикалом методом ЭПР.
Доказательство обратимости реакции спинового захвата 84 і лутатионового радикала нитронными спиновыми ловушками.
Образование ДЭФМПО/ЄБ* радикального аддукта в ходе 84 гибели ДМПО/СБ*.
Образование радикала СО2*' из ДМ ПО/Є8‘ в присутствии 86 формиата.
§3.2 Анализ кинетических данных 88
Кинетическая схема гибели радикального аддукта ST/GS*. 88
Анализ кинетической зависимости накоплении радикальною 90
аддукта DMPO/COj** в присутствии формата.
Накопление нитрона ДЭФМПО-SG при фотолизе GSNO. 91
Определение констант скоростей реакции GS* радикала 93
ДЭФМПО и GSNO методом лазерною импульсного фотолиза.
§3.3 Обсуждение полученных результатов. 94
Глава 4. Исследование механизма реакции дисульфида 2,3,5,6- 98
тетрафтор-парамеркапто-бензойной кислоты с низко- и высокомолекулярными тиолами.
§4.1 Результаты: 99
§4.2 Обсуждение полученных результатов. 104
Механизм реакции 104
Обсуждение причин уширения линий BSSB и BSH 105
§4.3. Применение BSSB для определения содержания тиолов в крови 109
§4.4 Достоинства, недостатки и перспективы развития метода. 111
Глава 5. Экспериментальная часть. 113
Используемая аббревиатура 113
§5.1. Реагенты 113
§5.2 Методы 114
§5.2.1. Измерения методом ЭПР. 114
§5.2.2. Измерения методом ЯМР 115
+
2
Ex vivo ЯМР измерения аддуктов ДЭФМПО 115
Изучен ие механизма реакции сульфита с ДЭФМПО. 115
Изучение механизма реакции сульфита сДМПО. 116
Изучение механизма реакции ДЭФМПО с тиогликолевой 116 кислотой
Изучение механизма реакции BSSB с тиолами. 117
Ex vivo ЯМР измерения содержания тиолов в крови 117
§5.2.3. Измерения методом УФ-спектроскопии. 117
§5.2.4. Фотолиз светом УФ лампы. 117
§5.2.5. Фотолиз светом лазера. 118
§5.2.6. Измерения методом лазерного импульсного фотолиза. 118
§5.3. Расчеты и обработка результатов измерений. 119
Выводы 120
Приложение 1. Параметры спектров ЭПР некоторых радикальных 121 аддуктов
Приложение 2. Параметры спектров ЯМР 123
Благодарности 124
Список литературы 125
#
3
Введение
Science is a wonderful thing if one does not have to earn one’s living at it.
A. Einstein
SH группы выполняют в организме несколько важных функций, такие как структурная функция, каталитический центр во множестве ферментов, функция защиты от действия свободных радикалов и т.д. ‘ Основным SII содержащим компонентом внутриклеточной среды является трипептид глутатион, концентрация которого может достигать в некоторых клетках до 10 мМ 2. Кроме того, достаточно большое количество белков содержит в своем составе SH группы, которые вместе с глутатионом играют роль окислительно-восстановительного буфера среды 3-4-5’6. Другим S-центрированным нуклеофилом, присутствующим в организме в достаточно больших количествах является сульфит, который вместе с оксидом серы IV в течение нескольких веков применяется в качестве консерванта, дезинфицирующего агента и
7 8 9 г»
раскислителя ' ’ . В настоящее время данное соединение широко используется в пищевой промышленности, так, за один прием пиши в организм человека попадает до 150 мг сульфита 10. Показано, что окисление рассматриваемых SH -соединений и сульфитов приводит к образованию соответствующих S-центрированных тиильных и сульфитного радикала, токсичность которых в последнее время активно обсуждается ||12Л314-,5>
В большинстве исследований по исследованию влияния данных радикалов в качестве метода их детектирования применялся метод спиновых ловушек 1617 ls'19>20-2,> в основе данного метода лежит реакция короткоживущих радикалов со специально подобранными химическими соединениями -спиновыми ловушками. Образующихся в результате реакции радикальный аддукт обычно представляет собой устойчивый нитроксильный радикал, спектр ЭПР которого несет информацию о котороткоживущем предшественнике22.
К настоящему моменту в литературе присутствует достаточное большое количество публикаций о регистрации радикальных аддуктов спиновых ловушек с S-центрированными короткоживущими радикалами, в том числе in vivo 2t)2->-2Am Последние часто рассматривают в качестве одного из доказательств присутствия короткоживущих радикалов in vivo и их токсичности. К сожалению большинство публикуемых работ обладают одним недостатком - образование радикальных
аддуктов прямо интерпретируется как присутствие короткоживущсго радикала в системе, и мало внимания уделяется рассмотрению других возможных механизмов образования данных аддуктов. Между тем, в настоящее время уже известен широких спектр побочных реакций, приводящих к образованию данных соединений
Метод спиновых ловушек в большинстве своих приложений был и остается качественным методом, используемым лишь для ответа на вопрос есть ли короткоживущие радикалы в системе или нет и какие если есть. В ряде случаев оказывается также возможным качественное наблюдение роста или убыли скорости продуцирования радикальных частиц. Однако количественное сравнение результатов независимых экспериментов в общем случае не представляется невозможным. Причина такого положения дел кроется в нестабильности радикальных аддуктов, что особенно ярко проявляется при использовании метода спиновых ловушек in vivo. Радикальные аддукты, по своей сути нитроксильные радикалы, достаточно легко восстанавливаются клеточными восстановителями, например аскорбиновой кислотой и/или SH-соединсниями. Традиционно проблему пытаются решить подбором структуры спиновой ловушки, которая бы минимизировала скорости реакций с восстанавливающими агентами. Однако существенного успеха до сих пор достигнуто не было.
Одним из недавно предложенных подходов в решении данной проблемы состоит в изменении схемы метода - а именно в детектировании не самих радикальных аддуктов, а диамагнитных продуктов их дальнейшей деградации. Относительная устойчивость диамагнитных соединений в восстановительной среде организма делает возможным накопление данный продуктов вплоть до концентраций, достаточных для детектирования методом ЯМР. Применение в данном случае спиновых ловушек, содержащих ядра J1P, l9F и спектроскопии магнитного резонанса на частоте соответствующих гетероядер (метод ЯМР Спиновых Ловушек, ЯМР-СЛ) позволяет существенно повысить чувствительность метода 32'33’34. Кроме того, использование в перспективе метода ЯМР томографии позволило бы визуализацию областей продуцирования свободных радикалов in vivo35.
Развитие метода ЯМР спиновых ловушек требует новых знаний о структуре образующихся диамагнитных соединений и о механизмах деградации радикальных аддуктов. Следует отметить, что данной области знания до
настоящего момента удс;1ялось крайне мало внимания. Накопленные к настоящему моменту знания в этой области в основном касаются лишь нескольких радикальных аддуктов и основываются скорее на качественных чем на количественных результатах 25*28*29’ Более того, до сих пор даже не
найдено объяснения приводимым в литературе разным характеристическим временам жизни аддуктов довольно популярных гидроксильного и супсроксидного радикалов 39,4°. Таким образом, установление механизма деградации радикальных аддуктов S-центрированных радикалов представляет большой научный и практический интерес.
Как уже упоминалось, SH-содержащис соединения играют важную роль в организме и соотношение концентраций их окисленных и восстановленных форм является одним из показателей окислительного стресса 3-4,5,6. Все существующие к настоящему времени методы измерения концентраций данных соединений так или иначе основываются на их выделении, что не позволяет
11 41 42 41 44 45 * *
применять данные методики непосредственно т vivo . Недавно
предложенный метод определения концентраций SH-соединсний, основанный на использовании дисульфид-бирадикалов, реагирующих с тиолами по механизму реакции тиол-дисульфидного обмена 46'47'48, позволяет снять данную проблему. Метод основан на детектировании образования монорадикальных компонентов, из анализа которой можно сделать вывод о концентрации тиола. Однако высокая скорость восстановления радикалов присутствующими в плазме клеток агентами, является главным фактором, сдерживающим его применение in vivo. Применение l9F меченных диамагнитных дисульфидов при их регистрации методом i9F ЯМР спектроскопии позволило бы снять последнюю проблему. Химический сдвиг ядер фтора очень чувствителен к ядрам ближнего и дальнего окружения, что проявляется в значительном отличии спектров ЯМР l9F фторированных дисульфидов и их SH-мономеров. Кроме того, применение в перспективе 19F ЯМР томографии позволило бы визуализацию картины распределения глутатиона и SH-соединений в целом внутри организма.
Цепью данной работы было исследование механизмов образования и деградации радикальных аддуктов S-центрированных радикалов с нитронными спиновыми ловушками и разработка метода регистрации SH-содержащих соединений с использованием фторированных дисульфидов и ЯМР 19F спектроскопии.
В первой главе представляемой работы проведен обзор литературы по исследованию роли короткоживущих интермедиатов in vivo и применения метода спиновых ловутск для их регистрации. Кроме того подробно рассмотрена роль SH-содержащих соединений в организме и их вовлеченность в процессы защиты от окислительного стресса и поддержания Ox-Red статуса. Большое внимание уделено рассмотрению химии метода спиновых ловушек и механизмам образования радикальных аддуктов. В конце главы рассматривается метод ЯМР спиновых ловушек и его применение для регистрации короткоживущих радикалов.
Во второй главе представлены материалы исследования реакции нитронных спиновых ловушек ДМПО и ДЭФМПО с сульфитом и некоторыми низкомолекулярными тиолами. В ходе проведенных исследований было впервые установлено, что данные S-центрированные нуклеофилы способны присоединяться к двойной связи нитронных спиновых ловушек с образованием соответствующих гидроксиламиновых производных. Полученные экспериментальные данные позволили определить механизм данной реакции, константы равновесия и скорости его соответствующих стадий. Было показано, что окисление образующихся гидроксиламинов приводит к образованию точно таких же радикальных аддуктов, что и при реакции спинового захвата. Данный механизм образования спиновых аддуктов известен в литературе как механизм Форрестера-Хэпбурна 30. В представляемой работе было показано, что неучет данного механизма реакции может привести к ложной трактовке результатов экспериментов по детектированию сульфитного радикала. Так, приведенные оценки некоторых литературных данных, свидетельствующих по мнению авторов о присутствии сульфитного радикала (в частности in vivo), ставят под сомнение данное утверждение.
В третьей главе представлены результаты исследования механизма деградации радикальных аддуктов тиильных радикалов с нитронными спиновыми ловушками. Впервые показано, что реакция спинового захвата S-ценгрированных радикалов является обратимой и одним из путей гибели радикальных аддуктов является мономолекулярная деградация на исходную ловушку и короткоживущий радикал. Количественный анализ механизма деградации радикальных аддуктов глутатионового радикала со спиновыми ловушками ДМПО и ДЭФМПО позволил установить соответствующие
константы скорости деградации и объяснить различные времена жизни радикальных аддуктов в зависимости от используемых концентраций реагентов. Также показано, что S-центрированные радикалы, образующиеся из-за распада радикальных аддуктов могут приводить к вторичным химическим процессам и образованию С-ценгрированных радикальных аддуктов, что объясняет некоторые приведенные в литературе экспериментальные данные о присутствии углерод-центрированных радикальных аддуктов при детектировании глутатионового радикала 49. В главе также обсуждается возможное участие данного мономолекулярного механизма в деградации радикальных аддуктов 0-центрированных радикалов.
В четвертой главе представлены результаты исследования механизма реакции дисульфида 2,3,5,6-тетрафтор-парамеркаптобензойной кислоты (BSSB) с различными SH-содержащими соединениями и применения данного соединения для определения тиолов ex vivo в крови. Установлено, что BSSB реагирует с достаточно высокой константой равновесия с алифатическими гиолами по реакции тиол-дисульфидного обмена. Образующийся в результате реакции мономер BSH вступает в аналогичную обменную реакцию с BSSB что приводит к уширению спектральных линий ЯМР данных компонентов. Количественный анализ экспериментальных данных позволил определить соответствующие константы равновесия и скорости отдельный стадий. В данной главе метод спектроскопии ЯМР ,9F впервые применен для определения содержания SH-соединений в крови и показано, что получаемые результаты очень хорошо согласуются с данными других методов. В конце главы проведено обсуждение перспектив развития метода и определены требования к структуре фторированных дисульфидов.
Использованные в работе приборы, методики и аббревиатура описаны в экспериментальной части (глава 5). Также в главе представлены детали компьютерных квантово-механических расчетов выполненных проф. Н И. Грицан и указан вклад соавторов в выполнение части экспериментов. Параметры спектров ЯМР некоторых полученных соединений приведены в Приложении 2.
Автор выражает признательность свои научным руководителям д.ф.-м.н. Елене Григорьевне Багрянской и д.х.н. Валерию Владимировичу Храмцову за осуществляемое руководство и постоянную заботу и всем кто это будет читать за их долготерпение.
Глава I. Литературный обзор. S-центрированные радикалы и нуклеофилы in vivo и in vitro.
§1.1. Короткоживущие реакционные радикалы и интермедиаты в биологии.
Если мысленным взором окинуть всю историю этой болтовни, легко увидеть, что так называемая теория мышления сводится к выдумыванию более или менее сложных терминов для обозначения явлений, которых человек нс лоннмаег.
Аркадий и Борис Стругацкие.
Краткая историческая справка.
Само понятие ((радикалы» зародилось более 200 лет назад (вторая половина XVIII века). Существование трифенилметильных радикалов впервые показал Гомберг в 1900 году 50, однако только с развитием квантовой механики удалось объяснить химическую природу радикалов, а непосредственно детектировать их стало возможных! с появлением метода электронного парамагнитного резонанса (Завойский, 1945). Таким образом, около 150 лет химики работали с соединениями, структуру которых не могли объяснить, и регистрировать которые не умели. Ситуация во многом схожа с наблюдающейся сегодня в биологических и клинических исследованиях: абсолютное
большинство положений об участии свободных радикалов в физиологических и патологических процессах основывается на непрямых методах регистрации, результаты которых исследователи пытаются свести в рамки логичных теоретических концепций '.
Впервые реакционная сущность радикалов была выявлена для кислородных радикалов Фентоном в 1894 году. Изучая окисление различных соединений, он показал, что окислительная способность перекиси водорода значительно возрастает в присутствии сульфата железа; эта смесь (Н2О2 с солями железа) была названа реактивом Фентона. В дальнейшем Габер и Вейс обнаружили, что высокая реакционная способность реактива Фентона обусловлена образованием ОН радикалов, и показали, что для протекания реакции необходимо восстановление ионов железа. Таким образом в 30-х годах был положен конец длительным дискуссиям, и учение о радикалах достигло своего апогея в работах Михаэлиса, который утверждал, что абсолютное
большинство химических реакций протекает через участие свободных радикалов1.
Мощным толчком в изучении роли радикалов в биологических процессах послужил взрыв атомной бомбы в 1945 году. Проведенные в 50-60 годах исследования показали, что действие ионизирующего излучения реализуется через образование радикалов, возникающих при расщеплении молекул воды:
>н20*+ё (1.1)
И20 >(Я20)»«-------->Н'+ОН* (1.1а)
Таким образом, стало ясно, что основным патогенетическим фактором лучевой болезни являются свободные радикалы. В то же время группой химиков во главе с лауреатом Нобелевской премии, H.H. Семеновым, была разработана теория радикального цепного окисления органических молекул, которая оказалась применимой для описания процесса окисления липидов в составе клеточных мембран. Объединив данные положения, Б.Н. Тарусов выдвинул концепцию о свободнорадикальной патологии, которая вызывается усилением процессов свободнорадикального окисления, в частности лучевая болезнь 51. Создатель института Биохимической физики РАН, академик Н.М. Эмануэль, впервые высказал предположение, что вызванные свободными радикалами повреждения могут играть важную роль в возникновении и развитии злокачественных новообразований 5г. Было также выяснено, что специальные соединения - антиоксиданты (антиокислители), ингибирующие радикалы, и тем самым снижающие токсичность их действия, обладают радиопротсктивным действием, более того, их применение оказалось эффективным в терапии многих других патологических процессов
Если патогенетическая роль свободных радикалов в живых организмах была выявлена и экспериментально доказана, то их положительные свойства были обнаружены только в 72-73 годах прошлого века 53, когда была показана связь дыхательного «взрыва» в фагоцитирующих клетках с наработкой активных форм кислорода. Оказалось, что микробицидная функция фагоцитов, осуществляющих защиту организма от бактериальных инфекций, во многом зависит от способности клеток нарабатывать супероксидный радикал и перекись водорода. Было установлено, что кислородные радикалы широко вовлечены в процессы неспецифичной резистентности организма и иммунорегуляции. Выяснилось также, что снижение их продукции ослабляет неспецифичный
иммунитет и может являться причиной распространения бактериальной инфекции.
Ярким примером тому служит генетически обусловленное заболевание -хронический гранулематоз, страдающие им люди умирают в раннем возрасте от бактериальных инфекций. Однако высокий уровень генерации реактивных форм кислорода фагоцитирующими клетками может вызвать повреждение клеток и тканей собственного организма и может лежать в основе аутоиммунной агрессии. Так, генерация кислородных радикалов приводит к окислительному повреждению биомолекул 54, к нарушению функций биомембран 5\ повреждению ДНК 5b,S7 и, в итоге к развитию патологий и старению.
Жизненно важная роль радикалов была выявлена в 1987 году, когда две независимые группы исследователей одновременно показали, что эндотелиальный фактор релаксации сосудов есть ни что иное, как NO-радикал 58.59 ц 1992 ГОДу ЖурИалом «Science» молекула N0 названа молекулой года, а в 1998 году за открытие биологической роли NO-радикатов группе американских исследователей присуждена Нобелевская премия в области физиологии и медицины. Исследования, проведенные в последнее десятилетие, показали, что свободные радикалы являются ключевыми элементами в регуляции многих физиологических процессов на всех уровнях: от регуляции активности внутриклеточных ферментов до нервной регуляции сократительной функции желудка и внешнего дыхания.
Однако и сегодня многие положения и концепции свободнорадикальной биологии остаются спорными, ибо, как правило, основываются на косвенных данных, дополняемых сложными логичными рассуждениями, что не всегда адекватно отражает многообразие реально протекающих процессов.
О-, С- и S- центрированные радикалы in vivo.
Кислород является самым распространенным элементом биосферы. Реакция восстановления молекулярного кислорода до воды составляет основу биоэнергетики всех аэробных организмов 60. Около 90% потребляемого человеком кислорода вовлекается в реакции окислительного фосфорилирования1. Вместе с тем во всех живых организмах постоянно протекают реакции с образованием активированных кислородных метаболитов (АКМ): С>2#\ О2', Н2О2, ОН, OCL RO2* и др. \ По оценке Эстербауэра м, человек
11
за 70 лет своей жизни потребляет 17 ООО кг кислорода, за это время в его организме нарабатывается 800-1700 кг кислородных радикалов.
Применительно к биологическим системам понятия «свободные радикалы» и «АКМ» не совпадают - неспаренный электрон может быть локализован на агомах углерода, серы, азота; так, для живых организмов большое значение имеют тиильные радикалы глутатиона (08*) или радикалы мочевой кислоты с локализацией электрона на атомах Б и N. С другой стороны, такие кислородсодержащие молекулы, как перекись водорода, синглетный кислород, гипогалоиды не являются радикалами, хотя и взаимодействуют с органическими молекулами через радикальные механизмы. Чтобы объединить данные соединения в одну группу с радикалами, вводят понятие «активные формы кислорода» или «реактивные формы кислорода», которым обозначают ферментативные продукты активации кислорода. Хотя некоторые авторы используют для обозначения данного класса соединений термин «АКМ» '.
Основным источником супероксидного радикала (Ог*’) в биологических системах являются ферментативные системы 1>62,63: митохондриальная цепь переноса электронов (до 5%) от общего количества переносимых электронов; фотосинтезирующая система хлоропластов растительных клеток, НАДН оксидаза фагоцитирующих клеток; ксантиноксидаза; микросомальные монооксигеназы. Супероксидный радикал также образуется в результате окисления восстановленных форм хинонов, флавинов, катехоламинов, а также во время метаболизма ксенобиотиков 164.
Супероксидный радикал является слабой кислотой рКа 4.7.
Н02'=Н++02- (1.2)
Супероксидные радикалы способны восстанавливать переходные металлы Ре34, Си2*, Со3* 65
О/'+Ре3* - 02 + Ре2* (1.3)
и вступать в реакцию диспропорционирования с образованием перекиси водорода:
02*+И02*+1Г =Н202 +02 (1.4)
Причем Ре2*, Си*, Со2* способны реагировать с перекисью водорода с образованием наиболее реакционно-способного гидроксильного радикала (ОН*) 65.66.67 (Реакция Фентона).
Н202 +/е2* = Геи +ОН~ +ОН' (1.5)
12
- Київ+380960830922