РАЗДЕЛ 2
ОБЪЕМ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ, КЛИНИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БОЛЬНЫХ
2.1. Объем и методы исследования
В основу работы положены наблюдения за детьми, страдающих нарушением пуринового обмена, биохимическим маркером которого является ГУ. Исследования проведены за период с 1999 по 2002 г.г. на базе городской детской клинической больницы № 16 г. Харькова, в школе - интернате № 4 Орджоникидзевского района г. Харькова.
Под нашим наблюдением находилось 94 ребенка в возрасте от 1 года до 15 лет, в том числе мальчиков - 55, девочек - 39, из них 80 детей с различными фенотипическими проявлениями гиперурикемии, 14 детей сверстников составили группу контроля.
В процессе наблюдения проводились общеклинические исследования с анализом анамнестических, клинико-лабораторных, инструментальных данных, статистических методов исследования; изучались различные способы коррекции НПО. Программа исследований включала оценку физического развития детей, характер течения анте-, интра- и постнатального периодов, наследственности, аллергологический анамнез, анализ сопутствующей патологии; лабораторные (клинические анализы крови и мочи, биохимические показатели крови и мочи, иммунологические показатели крови) и инструментальные методы исследований (УЗИ, ЭКГ).
Клинические исследования крови и мочи проводили по общепринятым методикам (Меньшиков В.В.) [102]; содержание общего белка - унифицированным биуретовым методом [102], фракционирование белков - методом горизонтального электрофореза [95]; гликопротеиды в сыворотке крови - резорциновым методом после гидролиза серной кислотой [102], серомукоид - турбидиметрическим методом [102]. Аланинтрасферазу (АлАТ) определяли по унифицированному методу Райтмана-Френкеля [102], щелочную фосфатазу (ЩФ) - с 4-аминофеназоном в присутствии йодита натрия, тимоловую пробу (ТП) - по Хуэрго и Поппери с тимолово-вероналовым буфером [102], билирубин (Б) определяли колорометрическим диазометодом по Иендрассику-Грофту [102]. Содержание электролитов (калия и натрия) в плазме измеряли пламенной фотометрией по методу В.М.Бриккер [37]. Содержание кальция в сыворотке крови - комплексонометрическим титрованием, неорганического фосфора - молибденово-кислым способом [149]. Сахар крови - унифицированным глюкозооксидазным методом [37]. Проводился тест на толерантность к глюкозе (ГТТ) [37]. Уровень оХС определяли пероксидазным методом (патент № 013.012-200) с использованием коммерческого диагностического набора Ольвекс-диагностикум. Определение липопротеидов высокой плотности (ЛПВП) осуществляли методом осаждения ?-липопротеидов гепарином в присутствии солей марганца [149] с использованием диагностических наборов Ольвекс диагностикум. Уровень ЛПНП - через образование гепарин-липопротеидового комплекса [102]. Уровень ТГ в сыворотке крови определяли унифицированным энзиматическим методом (патент № 61236). Математическим способом вычисляли ИА [37]:
оХС - ЛПВП-ХС
ИА =
ЛПВП-ХС
Помимо исследования клинического анализа мочи использовались методы количественного определения форменных элементов в моче (метод Нечипоренко). Для характеристики функционального состояния почек определялись уровни остаточного азота крови, мочевины диацетилмоноаксидомным унифицированным методом [102], креатинина по реакции Поппера [102], реабсорбции и скорость клубочковой фильтрации [102].
Состояние пуринового обмена оценивалось исходя из содержания макроэргических нуклеотидов в сыворотке крови, как начального этапа метаболизма пуриновых производных, содержания МК в сыворотке крови, суточной экскреции уратов с мочой. Содержание АТФ в сыворотке крови определяли ферментативным методом с помощью гексокиназы и глюкозо-6-Ф-дегидрогеназы [102]. Определение уровня АДФ, АМФ в сыворотке крови проводилось также ферментативным методом с использованием монокиназы, пируватиназы, лактатдегидрогеназы, основанном на сопряжении трех реакций - количественного превращения АДФ, сопровождающееся количественным превращением пирувата в лактат в присутствии избытка лактатдегидрогеназы [102]. Математическим путем вычисляли коэффициенты АТФ/АДФ, АДФ/АМФ, АТФ/АМФ, которые позволяли детализировать и уточнить характер динамических изменений внутри системы макроэргических нуклеотидов. Также математически по формуле Ван-Слайка вычисляли показатель Смк, в перерасчете на стандартную поверхность тела 1,73 м2 [82, 159]. МК сыворотки крови и ураты в моче определялись унифицированным фосфорновольфрамовым методом Мюллера-Зейферта [95, 102].
Иммунологические методы включали: определение уровней основных классов Ig (А, М, G) - методом радиальной иммунодиффузии в агаре Difko по G.Mancini et al. [225]; ЦИК - по методу V.Haskova et al.[223] в модификации Ю.А.Гриневича и А.Н. Алферова [102], фагоцитарную активность нейтрофилов - по количеству фагоцитирующих клеток, с помощью теста спонтанного поглощения и восстановления нитросинего тетразолия (НСT-тест) до нерастворимого диформазона по методу J.Stuart et al. в модификации Б.С.Нагоева [102]; определение субпопуляций лимфоцитов проводили с помощью моноклональных антител, меченных Fitc, методом иммунофлюоресценции на иммунофлюоресцентном микроскопе, использовались коммерческие наборы "Сорбен Лтд", Москва. Определяли относительное содержание всей популяции Т-лимфоцитов (CD3+ клетки), Т-хелперов (Тх, CD4+ клетки), Т-супрессоров (Тс, CD8+ клетки), натуральных киллеров (Тnk, CD16+ клетки), В-лимфоцитов (CD19+ клетки). Состояние интралейкоцитарных кислородзависимых и кислороднезависимых механизмов микробиоцидных систем полиморфноядерных нейтрофилов периферической крови оценивали по содержанию гранулоцитарных факторов - миелопероксидазы (МП) и лизосомально-катионных белков (ЛКБ). Рассчитывали средний цитохимический коэффициент содержания МП в нейтрофилах по методу Грэхема-Кноля и средний цитохимический коэффициент соде