ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В соответствии с целью и задачами работы в процессе выполнения исследований использованы эпидемиологический, бактериологический, молекуляр-но-генетический, статистический, а также метод электронного картографирования.
Эпидемиологический метод.
Источники эпидемиологических и клинических данных:
> Информационные сообщения Всемирной организации здравоохранения по заболеваемости холерой в мире с 1961 по 2005 г. (27 бюллетеней);
> Данные 27 территориальных органов санитарно-эпидемиологической службы Украины по заболеваемости, вибриононосительству и результатам исследований на холеру людей и объектов окружающей среды в Украине с 1970 по 2005 г. по расширенной форме (год, количество больных холерой / в т.ч. с бактериологичес-ким подтверждением, количество носителей, количество холерных вибрионов, выделенных из объектов окружающей среды);
> Оперативные сообщения о больном холерой (262) в 1994 г. в Симферополе;
> Отчеты по вспышкам в Крыму - в Керчи в 1970 г. (в т.ч. формы 1,2,3...60) и в Симферополе и Симферопольском районе в 1994 г.;
> Протокол проведения эксперимента по длительности сохранения и накоплению холерных вибрионов при температуре 37, 25, 7 оС;
> Протокол проведения эксперимента по длительности сохранения и накоплению холерных вибрионов при рН 6, 7, 9, 10;
> Паспорта штамов (12);
> Результаты определения генов ctx, tcp, toxR.
Особенности эпидемиологических проявлений холеры изучались с помощью метода эпидемиологического анализа [11, 15, 24]. Для оценки и анализа, собранные сведения, результаты исследований были сформированы в электронные базы данных с последующей математической обработкой с помощью компьютерной программы Excel. В процессе работы созданы базы данных:
* случаи заболевания холерой в мире, по континентам, странам;
* результаты мониторинга холеры в Украине;
* заболеваемость холерой в относительных показателях;
* характеристика культур холерных вибрионов О1 серогруппы, выделенных от людей в Украине в 7-ю пандемию;
* характеристика культур холерных вибрионов О1 серогруппы, выделенных из объектов окружающей среды в Украине с 1974 по 2005 г.;
* выживаемость культур холерных вибрионов.
Для комплексного эпидемиологического анализа использовалась геогра-фическая информационная технология - метод компьютерного картографирования в программе ArcGIS, версия 8.1., лицензионный номер Е 300 3/02.
ГИС-технологии - это способ электронного картографирования данных и обработки полученной информации. В основу метода положена разработка баз данных и построение на их основе электронных карт. Электронная географическая карта содержит информацию (слои) по: административному делению; климати-ческим условиям; физико-географическим; демографическим показателям и др.
Содержание ГИС заключается в точном отображении на географической элек-тронной карте объекта (явления, процесса), привязанного к конкретной точке на местности (ландшафт, водоисточник и т.д.), имеющей определенный адрес (место выявления случая заболевания, выделения возбудителя и т.д.).
ГИС в сочетании с другими методами, является вспомогательным инстру-ментом в работе по накоплению, сохранению, обработке и анализу данных.
Бактериологический метод.
Лабораторные исследования проводились специалистами бактериологической лаборатории Крымской противочумной станции МОЗ Украины.
Штаммы. Идентификация выделенных штаммов вибрионов и определение их биовара осуществляли по общепринятым методикам [40].
В работе использовано 2734 штамма холерных вибрионов О1 серогруппы биовара эльтор.
Наличие ctx-гена проверено у 2734 штаммов, выделенных за период с 1978 по 2005 г., в том числе 1368 - от людей и 1366 - из объектов окружающей среды. Наличие tcp гена и гена экспрессии toxR проверено у 652 штаммов, в том числе - 225 от людей (1991-2005 гг.) и 427 - из объектов окружающей среды (1997-2005 гг.).
Для экспериментальных исследований по выживаемости холерных вибрионов О1 при различных температурных условиях использовано 12 штаммов холерных вибрионов О1 группы, выделенных в период с 1991 по 1998 г., в том числе 3 культуры от людей и 9 - из объектов окружающей среды. Все культуры типичные по биологическим свойствам, однако, токсигенные свойства были различные - 7 штаммов содержали ген токсигенности, а 5 - были атоксигенными.
Для экспериментальных исследований по выживаемости холерных вибрионов О1 при различной рН использовано 9 штаммов холерных вибрионов О1 группы, выделенных в период с 1991 по 1998 г., в том числе 2 культуры от людей и 7 - из объектов окружающей среды. Все культуры были типичными по биологическим свойствам, однако токсигенные свойства были различные - 6 штаммов содержали ген токсигенности, а 3 - были атоксигенными.
Определение оптимальных условий обитания холерных вибрионов О1 серогруппы. Экспериментальные исследования проводились по нескольким параметрам:
> выживаемость холерных вибрионов О1 при температуре +7 оС, +25 оС, +37 оС в 0,9 % растворе NaCl и автоклавированной морской воде (м.в.). Эксперимент проводился в течение 12 месяцев с высевом каждые 30 дней;
> выживаемость холерных вибрионов О1 при различной рН (6, 7, 9, 10) в автоклавированном 0,9 % растворе NaCl и в автоклавированной морской воде (рН 7,3). Эксперимент проводился в течение 13 месяцев при температуре +25 оС с высевом каждые 30 дней.
Искусственная контаминация субстратов, в которых проводился эксперимент, осуществлялась различными штаммами в дозе 103 микробных клеток.
Ежемесячно в каждом из экспериментов изучались: концентрация микробных клеток в 1 мл среды, время выживания штаммов в экспериментальных условиях культивирования микроорганизмов в зависимости от абиотических факторов (температуры, рН, вида субстрата).
Через 30 дней в каждом эксперименте проводились высевы проб в количестве 0,1 мл суспензии в исходных концентрациях на 3 чашки с щелочным агаром. При сплошном росте высеваемую взвесь разводили изотон
- Київ+380960830922