РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ
Дослідження проводили у період з 1997 по 2005 рік у лабораторії вірусології та
лабораторії епізоотології Національного наукового центру „Інституту
експериментальної і кліничної ветеринарної медицини (ННЦ „ІЕКВМ”), у
відповідності з плановими темами: 05.01 „Розробити засоби і методи діагностики
та специфічної профілактики вірусної діареї великої рогатої худоби” номер
Держреєстрації 0101U001610, 04.05 „Розробити систему епізотологічного
моніторингу пестивірусних інфекцій” номер Держреєстрації 0101U001616, у
виробничих умовах - у дослідному господарстві „Елітне” Інституту рослинництва
ім. Юр’єва УААН та у ТОВ „Агрофірма Маяк” Котелевського району Полтавської
області.
Міжлабораторні комісійні випробування проводили на базі ННЦ „ІЕКВМ”. Міжвідомчі
комісійні випробування проводили за наказом Держдепартаменту ветеринарної
медицини № 34 від 30 березня 2005 року [додаток И], згідно затвердженої
методики випробувань.
Проби сироватки крові від великої рогатої худоби отримували з господарств
Харківської та Полтавської областей.
Віруси
У дослідах використовували вірус діареї великої рогатої худоби штами: “Oregon C
24 V” - еталонний з колекції вірусних штамів лабораторії вірусології ІЕКВМ,
“25” – епізоотичний, який виділено співробітниками УНДІЕВ у 1967 році та „ВК-
1” – епізоотичний, виділений у лабораторії вірусології ІЕКВМ.
Титр інфекційної активності ВД на перещеплюваній культурі нирки теляти (НТ)
становив 5,5 lg ТЦД50/см3 для штаму “Oregon C 24 V”; 5,0 lg ТЦД50/см3 для штаму
“25” та 5,75 lg ТЦД50/см3 для штаму „ВК- 1”.
Культури клітин
При проведенні досліджень щодо підбору клітинної системи – продуценту біомаси
вірусу діареї великої рогатої худоби за показниками чутливості до вірусу та
репродуктивній активності вірусу в культурі клітин були випробувані
перещеплювані лінії клітин трахеї теляти (ТрТ), нирки вівці (НВ), коронарних
судин теляти (КСТ), нирки теляти (НТ). Культури отримано з банку клітинних
культур лабораторії біотехнології ІЕКВМ.
Клітини культивували стаціонарним методом у матрасах різного об’єму від 50 до
1500 см3, у пробірках, та мікропланшетах за температури 37,5 єС в умовах
термостату. В якості ростового середовища використовували суміш середовищ Ігла
та 199 з додаванням 10 % сироватки крові великої рогатої худоби вільної від
антитіл до вірусу діареї ВРХ та антибіотиків (стрептоміцину сульфат –
100 мг/см3, бензилпеніциліну натрієвої солі – 100 мг/см3).
Тварини
Визначення нешкідливості дослідних зразків та дослідних серій інактивованої
вакцини проти вірусної діареї великої рогатої худоби проведено на 160 білих
мишах вагою 20 – 25 г.
При дослідженні антигенної спорідненості та відмінностей між різними штамами
вірусу діареї, для отримання штамоспецифічних сироваток було використано 12
кролів породи Шиншила вагою від 3,5 до 4,0 кг.
Імуногормональну відповідь на щеплення кролів живим та інактивованим вірусом
діареї визначали на 15 кролях породи Шиншила вагою 2,5 – 3,0 кг.
Реактогенні та антигенні властивості дослідних зразків інактивованої вакцини
проти вірусної діареї великої рогатої худоби проводили на 15 кролях породи
Шиншила вагою 2,5 – 3,0 кг.
Визначення імуногенної активності зразків вакцини та імунізуючої дози
здійснювали у ДГ „Елітне” Інституту рослинництва ім. Юр’єва на 48 телятах 3 – 4
місячного віку та 60 коровах.
Комісійні випробування вакцини проводили за наказом голови Держдепартамента
ветеринарної медицини України у ТОВ „Агрофірма Маяк” Котелевського району,
Полтавської області, в ході яких було застосовано понад 4 тис. доз вакцини
інактивованої проти вірусної діареї великої рогатої худоби.
Антигенну активність серій вакцини визначали на морських свинках, для чого було
використано 50 тварин живою масою 250 – 300 г.
При проведенні досліджень керувалися принципами гуманного відношення до тварин
у відповідності з Міжнародними рекомендаціями [49], із дотриманням біоетичних
норм та вимог Міжнародного комітету по науці [92] та згідно вимог статті 26
закону України про захист тварин від жорстокого поводження (правила поводження
з тваринами що використовуються в наукових експериментах, тестуванні,
навчальному процесі та виробництві біопрепаратів).
Методика епізоотологічних досліджень
Епізоотологічний моніторинг вірусної діареї ВРХ проводили з використанням
епізоотологічного, картографічного та статистичного методів досліджень. При
цьому були проаналізовані дані Міжнародного Епізоотичного Бюро (МЕБ) щодо
епізоотичної ситуації з ВД за 1996 - 2004 роки.
Для оцінки епізоотичної ситуації у світі за період досліджень було відмічено
статус країн щодо вірусної діареї, визначені та нанесені на мапу країни, що
застосовують вакцинацію проти ВД та проаналізована по роках загальна кількість
вакцинованих проти ВД тварин у світі за звітними даними МЕБ.
Методи отримання сироваток
Кров у лабораторних та сільськогосподарських тварин відбирали з дотриманням
правил антисептики та з дотриманням вимог гуманного відношення до тварин.
Сироватку отримували за методом ретракції кров’яного згустка, для чого флакони
або пробірки з кров’ю поміщали на 1 годину у термостат за температури 37,5 °С,
після чого обводили стерильною скляною паличкою та переносили у побутовий
холодильник, де витримували протягом 10 – 18 годин за температури 4 °С. Після
цього сироватку зливали і центрифугували протягом 15 хв. при 2000 об/хв. До
подальшого використання сироватку зберігали за температури мінус (19 ± 2) °С.
Нормальну сироватку кроля отримували стерильно від клінічно здорових кролів
масою 3 – 3,5 кг.
Для одержання специфічної гіперімунної до вірусу ВД сироватки, імунізували
доросли
- Київ+380960830922