РОЗДІЛ 2
МЕТОДИ І ОБ'ЄКТ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Відбір тварин для дослідження
Всі експерименти на тваринах проводили з дотриманням Міжнародних принципів Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментів та інших наукових цілей (Страсбург, 1985).
Досліди виконані на 140 білих безпородних щурах, які утримувались на стандартному раціоні віварію. Моделлю токсичного ураження печінки слугувала інтоксикація щурів тетрахлорметаном, який вводили підшкірно протягом 4 діб у вигляді 50 % розчину на олії в дозі 2 г/кг маси. Тварин із експерименту виводили через 1, 3 і 7 діб повного голоду та через 7 діб відновного харчування.
Матеріалами дослідження були гомогенат печінки, плазма і сироватка крові, еритроцити крові, тканина печінки.
Всі піддослідні тварини були поділені на такі групи: І - інтактні, ІІ - щури, які знаходились на повному голодуванні з вільним доступом до води, ІІІ - з тетрахлорметановим гепатозом, ІV - з токсичним гепатозом, які знаходились на повному голодуванні, V - з токсичним гепатозом, які утримувались на повному голодуванні в поєднанні з ентеросорбентом. Сорбент ентеросгель в дозі 0,2 г/кг маси вводили внутрішньошлунково.
Всі експерименти на тваринах проводили у відповідності з "Правилами використання лабораторних експериментальних тварин".
2.2. Методи визначення активності процесів вільнорадикального окислення
2.2.1. Визначення вмісту малонового діальдегіду. Принцип методу полягає у здатності малонового діальдегіду (МДА) при взаємодії з тіобарбітуровою кислотою в кислому середовищі давати кольоровий комплекс, інтенсивність якого відповідає вмісту малонового діальдегіду. Вміст його визначали у плазмі крові і в 10 % гомогенаті печінки [201].
У центрифужні пробірки наливали по 1 мл дистильованої води, 1 мл 10 % гомогенату або 0,5 мл плазми, 2 мл 30 % розчину трихлороцтової кислоти, 0,2 мл 5 ммоль/л розчину НСl, 2 мл тіобарбітурової кислоти і витримували 15 хв на водяній бані при температурі 100 0С. Проби охолоджували, осад відділяли центрифугуванням при 3000 об/хв протягом 10 хв. Оптичну щільність верхньої фази вимірювали на фотоелектроколориметрі КФК-3 при довжині хвилі ? = 535 нм проти води. Розрахунок робили, враховуючи коефіцієнт молярної екстинції для малонового діальдегіду (1,56 х 106 моль х см-1).
Активність виражали в мкмоль/л у плазмі крові та мкмоль/кг в гомогенаті печінки.
2.2.2. Визначення вмісту дієнових кон'югатів. Концентрацію дієнових кон'югатів (ДК) визначали за методом [201], який базується на тому, що екстраговані гептан-ізопропіловою сумішшю гідроперекиси мають відповідний максимум поглинання при довжині хвилі ? = 232 нм.
До 0,2 мл плазми або 10 % гомогенату печінки додавали 4 мл суміші гептанізопропанолу (1:1) і струшували 15 хв (струшувач АВ-30с)). Потім у пробірки додавали по 1 мл розчину НСl (рН = 2,0) і 2 мл гептану, інтенсивно струшували і після відстоювання та розшарування суміші (через 30 хв) відбирали гептановий шар і вимірювали його оптичну щільність на спектрофотометрі СФ-46 при довжині хвилі ? = 232. Як контроль використовували пробу, яка містила 0,2 мл дистильованої води замість експериментального матеріалу. Розрахунок вмісту ДК проводили у відносних одиницях за формулою:
С = 10 . Е . V1/V2 (2.1)
де С - концентрація дієнових кон'югат у плазмі крові, ум.од./л,
Е - оптична щільність гептанового шару проби,
V1 - кінцевий об'єм гептанового екстракту (4 мл),
V2 - об'єм досліджуваного матеріалу (2 мл),
С = Е . V1/V2 для печінки, (2.2)
де С - концентрація дієнових кон'югат в гомогенаті печінки, ум.од./кг
Е - оптична щільність гептанового шару проби,
V1 - кінцевий об'єм гептанового екстракту (4 мл),
V2 - об'єм досліджуваного матеріалу (2 мл).
2.3. Визначення функціонального стану антиоксидантної системи
2.3.1. Визначення активності каталази. Активність каталази визначали за методом [95]. Принцип методу ґрунтується на здатності перекису водню утворювати з молібдатом амонію стійкий забарвлений комплекс.
Досліджували плазму крові і тканину печінки, з якої на холоді готували 10 % гомогенат на 0,05 М тріс-буфері (рН = 7,8). До 0,1 мл плазми або гомогенату додавали до 2 мл 0,03 % розчину перекису водню. Контрольну пробу замість досліджуваного субстрату додавали 0,1 мл дистильованої води. Через 10 хв реакцію зупиняли додаванням 1 мл 4 % молібдату амонію. Інтенсивність забарвлення вимірювали на спектрофотометрі СФ-46 при 410 нм проти контрольної проби, в яку замість перекису водню додавали 2 мл води. Активність каталази розраховували за формулою:
А = (Ех - Ед) / vtк, (2.3)
де А - активність каталази, кат/л - у плазмі крові, кат/кг - в гомогенаті печінки
Ех - екстинція холостої проби,
Ед - екстинція дослідної проби,
t - час інкубації (с),
к - коефіцієнт молярної екстинції перекису водню, який дорівнює 22,2 х 103 М-1см-1.
2.3.2. Визначення вмісту церуплазміну в плазмі крові. Рівень церулоплазміну визначали за методом [73]. Принцип методу: окислення n-фенілендиаміну в присутності церулоплазміну приводить до утворення забарвлених продуктів. Кількість церулоплазміну пропорційна інтенсивності забарвлення.
Досліджували плазму крові без слідів гемолізу. В пробірки вносили по 0,1 мл плазми. В контрольну - додавали 1 мл 0,5 % розчину гідроксиламіну солянокислого з метою інактивації ферменту. У всі пробірки додавали по 8 мл 0,4 М розчину ацетатного буфера (рН = 5,5) і по 1 мл n-фенілендиаміну. Пробірки закривали і витримували в термостаті при температурі 37 0С 1 годину. Потім у кожну пробірку, крім контролю, додавали по 1 мл гідроксиламіну солянокислого. Проби витримувал