РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Матеріали та умови проведення дослідів
Обстежено 72 практично здорових донорів (контрольна група) віком від 21 до 55
років та 144 хворих на ЦД 1-го типу віком
28-55 років із терміном захворювання від 5 до 15 років з моменту клінічної
маніфестації. Щоб нівелювати вплив різних видів терапії, нами відбиралися
пацієнти, які здавали кров під час надходження в стаціонар у стадії
некомпенсованого діабету.
Експериментальний цукровий діабет (ЕЦД) у щурів викликали введенням
стрептозотоцину (“Sigma”, США) з розрахунку 7 мг на 100 г маси тіла
дочеревинно. Розвиток діабету контролювали за вмістом глюкози в крові, яку
визначали глюкозооксидазним методом з використанням набору реактивів “Lachema”
(Чехія) [Tringer, 1969]. В експериментах in vivo через 72 години від початку
маніфестації діабету тваринам per os вводилися з питною водою: L-аргінін
(L-arg) (“Reanal”, Угорщина) у концентрації 1,25 г/л протягом 14 днів та
аміногуанідин (AG) (“Sigma”, США) у концентрації 1 г/л протягом 30 днів.
Дослідження проводили в таких групах: 1. Контроль (К); 2. К + L-arg;
3. К + AG; 4. ЕЦД; 5. ЕЦД + L-arg; 6. ЕЦД + AG. В експерименті було задіяно 112
тварин.
У роботі були викopиcтaні моноклональні антитіла фірми “Сорбент” (Росія) для
визначення субпопуляцій лімфоцитів; екзогенний донор оксиду азоту –
S-нітрозоглутатіон (“Sigma”, США); реагенти для посиленої хемілюмінесценції
(“Amersham”, Велика Британія); нітроцелюлозна мембрана (“Osmonics”, США);
лектини: RCA – лектин рицини, WGA – лектин зародків пшениці, SBA – лектин сої,
LCL – лектин сочевиці (всі лектини були люб’язно надані д.б.н. Луциком М.Д.,
Інститут біології клітини НАН України, м. Львів); лектини (RCA, WGA, SBA, LCL),
мічені пероксидазою хрону (“Лектинотест”, Україна).
Об’єкт досліджень
Об’єктом досліджень слугували лейкоцити перифеичної крові.
Як об’єкт фагоцитозу використовували дріжджові клітини виду Debarіomyces
hanseniї профарбовані VCM У-102, вбиті нагріванням при Т=60°С, 30 хв.
Забір крові у донорів
Забір крові проводили з пальця або вени у стерильні силіконізовані пробірки.
Процесу згортання запобігали попередньо додавши в посуд гепарин (кінцеве
розведення 1:100) у співвідношенні 1:10 (гепарин : цільна кров). Для оцінки
імунного статусу використовували кров, а у якості антикоагулянта
використовували 1,5% розчин ЕДТА (на 2 мл крові брали 0,1 мл розчину).
2.4. Отримання лейкоконцентрату з крові [197]
Для відділення еритроцитів до гепаринізованої крові додавали 1/5 об’єму 5%
декстрану Т-500. Інкубували у стерильному пластиковому шприці 15 хв.
Лейкоконцетрат витискали із шприца у стерильні пробірки типу Еппендорф.
Морфологічні дослідження лейкоцитів крові [87]
Підрахунок лейкоцитів проводили згідно методу [87]. Із лейкоконцентрату робили
мазки. Сухі мазки фіксували та фарбували після за Романовського-Гімза.
Лейкоцитарну формулу визначали у профарбованих мазках.
Розрахунок лімфоцитарно-гранулоцитарного індексу (ЛГІ) у лейкоконцентраті
дозволяє диференціювати аутоінтоксикацію та інфекційну інтоксикацію:
ЛГІ=
лімфоцити Ч 10
мієлоцити+метамієлоцити+паличкоядерні+базофіли+ сегментоядерні+еозинофіли
Морфометричний аналіз мононуклеарів периферичної крові проводили за допомогою
мікрометра окулярного гвинтового АМ-92. На мазку знаходили ділянки з
недеформованими мононуклеарами, проводили вимірювання. Мононуклеари групували
відповідно за розміром по групах: А (>7мкм); В (8>11мкм); С (>12мкм). Визначали
процентний вміст клітин кожної групи відповідно до їх діаметра.
Імунні дослідження
Імуноцитохімічні дослідження лімфоцитів [51]
Препарат типу “висушеної краплі”. На предметне скло нанесили 0,05 мл суспензії
виділених з градієнту густини фікол-верографін (d=1,076-1,078) і відмитих
мононуклеарних клітин з концентрацією 2 млн/мл. Поміщали скло у вологу камеру і
залишали при 4єС для осідання клітин в горизонтальному положенні. Через 40 хв
скло висушували при кімнатній температурі. Фіксацію мазків здійснювали протягом
3 хв. у парах 10% нейтрального формаліну.
З метою оцінки імунного статусу використовували набір моноклональних антитіл
фірми “Сорбент” (Росія) для визначення субпопуляцій лімфоцитів.
Мононуклеари крові, в кількості 2-4 млн. вносили у пробірки і центрифугували
при 1500 об/хв. Інкубували 20 хв. при кімнатній температурі з попередньо
інактивованою протягом 30 хв. при 56єС нормальною кролячою сироваткою
розведеною 1:10 (блокування Fc-рецепторів). Відмивали 1 раз ЗФР, відділяли
супернатант і до осаду додавали 50-100 мкл МКАТ до відповідно досліджуваного
CD. Ресуспендували і інкубували 30 хв. при 4єС. Відмивали ЗФР, відділяли
супернатант і до осаду додавали 50-100 мкл кон’югованої з ФІТЦ кролячої
антисироватки до Ig миші. Ресуспендували, інкубували 30 хв. при 4єС. Відмивали
ЗФР. Ресуспендували в 50-100 мкл 50% гліцерину. Наносили краплю суспензії на
предметне скло. Препарат досліджували в люмінесцентному мікроскопі.
Використовували фазово-контрастну мікроскопію, збільшення об’єктиву-90.
Визначення концентрації основних класів імуноглобулінів методом радіальної
імунодифузії в гелі
1,5% агаровий гель змішували відповідно до титру з антисироваткою при 56єС. В
якості антисироваток використовували моноспецифічні сироватки проти IgG, IgM,
IgA. Агар готували на медінал–вероналовому буфері (рН 7,4) та заливали на
пластинку. В кожну лунку вносили по 5 мкл досліджуваної сироватки. В перші 5
лунок вносили стандарти по 5 мкл зі зростаючою концентрацією. Поміщали у вологу
камеру при кімнатній температурі для IgA та IgG на 24 години, IgM – 48 годин.
Через 24 – 48 годин препарат розглядали в світлому мак
- Киев+380960830922