РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Матеріалом для дослідження служила периферична кров 50 практично здорових людей (донорів) (21 жінка та 29 чоловіків, середній вік (39,1±1,1) років) та 126 хворих на виразкову хворобу дванадцятипалої кишки до та після лікування (Додаток А). Для вирішення поставлених завдань використовувалися клінічні, інструментальні, мікроскопічні, молекулярно-біологічні та імунологічні дослідження.
2.1. Загальна характеристика обстежених хворих
Хворі перебували на стаціонарному лікуванні у відділенні захворювань шлунка та дванадцятипалої кишки Інституту гастроентерології АМН України. Серед обстежених було 34 жінки і 92 чоловіки, середній вік склав (41,56±1,29) років. Верифікація діагнозу проводилась на підставі клінічних, ендоскопічних та морфологічних даних. У 97 пацієнтів з ВХ ДПК за допомогою уреазного тесту та цитологічного дослідження була визначена наявність Нр. Усі хворі були розподілені на 3 групи. І-у групу склали 58 обстежених, у яких методом ПЛР був виявлений токсигенний штам Нр (tox+); ІІ-у групу - 39 хворих, у яких токсигенні штами Нр (tox-) не виявлені, та ІІІ-ю - 29 хворих на ВХ ДПК без хелікобактерної інфекції (Нр-) (табл. 2.1).
Таблиця 2.1.
Розподіл хворих в залежності від наявності Нр
ХарактеристикаКількістьабс.%Нр tox+
(CagA+ VacA-; CagA- VacA+; CagA+ VacA+)5846,03Нр tox-
(CagA-, VacA-, CagA- VacA-)3930,95Нр-2923,02Кількість126100
У 27 (46,6 %) Нр+ хворих виявлено токсигенний штам CagA+VacA- Нр, у 10 (17,2 %) - штам CagA-VacA+ та у 21 (36,2 %) - штам CagA+ VacA+ Нр (рис. 2. 1).
Для вирішення поставлених завдань у ході роботи дослідження проводились в умовах in vitro та in vivo. Для вирішення питання щодо стану імунної системи організму вивчено Т-клітинну та В-клітинну ланки імунної системи, та основних їх субпопуляцій (СD3+, СD4+, СD8+, СD16+, СD19+), визначена рецепторна активність лімфоцитів (СD25+, СD95+, HLA-DR+). В сироватці крові вивчали рівні імуноглобулінів класів А, М, G і циркулюючих імунних комплексів (ЦІК). Функціональну активність нейтрофілів визначали за допомогою НСТ-тесту та фагоцитозу тест-культури. Вплив ВІМП здійснювався за допомогою апарата "Вітма" (Патенти України №99010224 та №29009. Свідоцтво про державну реєстрацію №4922/2006 на апарат магнітної терапії "Вітма" ТУ У 33.1-13429839-003:2006) [90, 113, 114]. Параметри магнітного поля становили: радіальна складова 5 - 10 мТл, тангенціальна складова 0,5 - 15 мТл, частота модуляції магнітного поля 75 - 85 Гц. Вплив ВІМП тривав 15 хвилин.
2.2. Визначення цитотоксичних штамів Helicobaсter pylori
Для вивчення генної структури та поліморфізму Hp було використано один із сучасних методів молекулярної біології, а саме метод вивчення ДНК на основі ПЛР, який був запропонований К.Б.Мюллісом (США) [236] і згодом адаптований для вивчення ДНК різних організмів. ПЛР - це метод ампліфікації in vitro, за допомогою якого протягом кількох годин можливо виділити і розмножити певну послідовність ДНК в кількості, яка перевищує початкову в 106 разів. Принцип ПЛР застосовано для ампліфікації ДНК за допомогою ферменту ДНК-полімерази, який здійснює синтез взаємно комплементарних ланок ДНК, починаючи з двох олігонуклеотидних праймерів - прямого і зворотного. Праймери комплементарні протилежним ланкам ДНК в ділянках, які відокремлюють обрану область і зорієнтовані трьома кінцівками назустріч один одному в бік тієї послідовності, яку необхідно ампліфікувати. Таким чином, синтез нової ланки може бути тільки в одному напрямку, починаючи з третьої кінцівки в бік зустрічного праймера. ПЛР - циклічний процес: на першій стадії (денатурація або плавлення) відбувається розрив водневих зв'язків, які поєднують дві нитки ДНК, на другій стадії - олігонуклеотидні праймери комплементарно з'єднуються з матричною ДНК, а на стадії синтезу ДНК-полімераза добудовує нуклеотиди комплементарно матричної ДНК. При цьому праймер приєднується до складу знову синтезованої ділянки нуклеїнової кислоти [10, 89].
Діагностика штаму Нр за допомогою ПЛР проводилась в такому порядку: підготовка зразків, виділення та очищення ДНК, підготовка та проведення самої ПЛР, розподіл фрагментів ДНК-продуктів ПЛР за допомогою гель-електрофорезу в агарозних гелях, фіксація результатів та їх обробка.
ДНК Hp виділяли з біоптатів з використанням спеціальних наборів (Insta Gene Matrix, Bio Rad; набори для виділення ДНК "Лагис", "Литех"). Для проведення ПЛР використовували комплект для ПЛР-ампліфікації ДНК Нр CagA+ та VacA+ ("Ниармедик плюс", Москва). ПЛР проводили на ампліфікаторі за такою програмою: 920С 120 с, 1 цикл; 920С 20 с, 650С 25 с, 7290С 25 с - 10 циклів; 920С 20 с, 640С 20 с, 720С 20 с - 35 циклів. Продукти реакції ампліфікації оцінювали за результатами електрофорезу у 2% агарозному гелі, який містив 0,5 мкг/мл бромистого етидію. Інтенсивність сигналу у гелі визначали за допомогою таких критеріїв: слабкий сигнал (+), помірний сигнал (++), сильний сигнал (+++). В розробку брали результати з помірним та сильним сигналом.
Таким чином, метод ПЛР піднімає діагностику на принципово новий рівень - рівень ДНК, що дозволяє точно визначити не тільки наявність інфекційного агента, але й виявити токсигенний штам Hp (CagA+) та Hp (VacA+).
Для проведення полімеразно-ланцюгової реакції (ПЛР) отримували біопсійний матеріал. Для одержання біопсійного матеріалу використовували рекомендації Сіднейського конгресу гастроентерологів - біопсію брали з передньої стінки антрального відділу і середньої частини тіла шлунка [6, 128].
2.3. Оцінка фагоцитарної ланки імунітету
2.3.1. Фагоцитарна активність нейтрофілів
Бактерицидну здатність нейтрофілів периферичної крові вивчали стандартними методами дослідження за допомогою проведення фагоцитозу прямим візуальним методом (Меншиков В.В., 1987) [73]. Принцип методу полягає в тому, що поліморфноядерні лейкоцити периферичної крові здатні зв`язувати на своїй поверхні, поглинати і перетравлювати мікробну