РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектом исследования служили суспензии интерстициальных клеток и фрагментов
семенников 4-5 месячных самцов белых беспородных крыс. Эксперименты с
моделированием различных андроген-дефицитных состояний и трансплантации также
были проведены на самцах белых беспородных крыс, содержащихся в условиях
вивария при Институте проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины. Всего в
эксперименте было задействовано 250 животных.
Эксперименты проведены в соответствии с «Общими принципами экспериментов на
животных», одобренными I Национальным конгрессом по биоэтике (20.09.01 г.,
Киев, Украина) [28] и согласованными с положениями «Европейской Конвенции о
защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других
научных целей» (Страсбург, 1985).
2.1. Получение фрагментов семенников и суспензии клеток интерстиция
Получение фрагментов семенников (ФС) взрослых крыс осуществляли следующим
образом. После экстирпации семенники освобождали от оболочек, измельчали на
фрагменты 1 – 2 мм3, промывали от крови средой 199 и использовали далее в
работе.
Получение суспензии клеток интерстиция (СКИ) взрослых крыс проводилось
приведенным ниже способом. После экстрипации семенники освобождали от оболочек.
Ткань измельчали на фрагменты и подвергали мягкой обработке коллагеназой
(4мг/мл) на среде 199 с 20 мМ Hepes (рН = 7,2–7,4) при 32-34°C и непрерывном
помешивании на протяжении 15 мин. Перед разделением полученной суспензии клеток
в градиентах сахарозы и фикола осуществляли первичное осаждение тубулярных
структур. После разделения в ступенчатом градиенте плотности сахарозы были
получены 3 фракции клеток: ФрАс (1,127-1,176г/см3), ФрВс (1,081-1,127г/см3),
ФрСс (1,038-1,081г/см3). В ступенчатом градиенте плотности фикола были получены
2 фракции: ФрАф (1,06-1,08г/см3), ФрВф (1,04-1,06г/см3). После разделения
клетки были отмыты средой 199 с 20мМ Hepes (рН=7,4) и использованы далее в
работе.
2.2. Культивирование СКИ
Культивирование СКИ осуществляли в пластиковых чашках Петри диаметром 2,5см на
среде 199 с добавлением 0,1% телячьей сыворотки и 20мМ Hepes (рН = 7,2–7,4) при
32-34°C на протяжении 7 дней. При работе с клетками в среду были добавлены
антибиотики широкого спектра действия (пенициллин – 100 ед/мл и канамицин –75
ед/мл). На дно чашки Петри были опущены покровные стекла, на которые после
добавления питательной среды были внесены 2-2,5ґ106 интерстициальных клеток.
Замена среды осуществлялась через день. Собранная среда была исследована на
предмет содержания тестостерона. При замене питательной среды часть покровных
стекол с прикрепившимися на них клетками интерстиция изымалась. Клетки,
прикрепленные к покровным стеклам, после фиксации в метаноле, окрашивались
гематоксилин-эозином и исследовались под световым микроскопом.
2.3. Исследование сохранности и функциональной активности СКИ
Исследование сохранности и функциональной активности клеток после пребываниия с
растворами ДМСО проводили следующим образом. Растворы ДМСО добавляли в объеме
1:1 к клеткам для получения конечных концентраций 5, 10 и 15%. После 30 мин
инкубации клеток при температуре 2–4°С производили удаление ДМСО из клеток
путем постепенного снижения его концентрации в среде. После чего исследовали
сохранность клеток и секрецию тестостерона в среде инкубации.
Сохранность контролировали методом суправитального окрашивания клеток
трипановым синим [42]. Общую сохранность клеток после криоконсервирования по
различным программам охлаждения выражали в процентном отношении к клеткам до
замораживания.
При исследовании базальной и стимулированной секреции осуществляли инкубацию
клеток в среде 199 с 20 мМ Hepes в течение 1 часа при 32-34°C. В качестве
стимулятора стероидогенеза использовали хорионический гонадотропин (ХГ),
который в концентрации 1 МЕ/мл добавляли в среду инкубации перед началом
исследования.
2.4. Органотипическое культивирование тканей семенников
После получения ФС органотипическое культивирование осуществляли по методу
[49]. Соотношение между тканью и средой составляло 1:6(7) по весу. Производили
замену питательной среды и культивировали при 32 - 34°С. Все последующие замены
питательной среды осуществляли в одно и то же время каждые сутки. Среда
культивирования включала смесь среды 199, в которой содержались 0,1%
инактивированная эмбриональная сыворотка теленка и антибиотики (пенициллин –
100 ед/мл и канамицин – 75 мкг/мл). Культивирование осуществляли в течение 7
суток. Среду культивирования исследовали на предмет содержания тестостерона
радиоиммунологическим методом.
Содержение тестостерона измеряли в инкубационной среде радиоиммунологическим
методом при помощи наборов «РИА СТ-тестостерон» (Беларусь).
2.5. Криоконсервирование СКИ и ФС крыс
Криоконсервирование СКИ и ФС проводили с использованием криопротектора ДМСО,
раствор которого готовили на среде 199 с 20 мМ Hepes. Растворы ДМСО добавляли к
среде с биологическим материалом для получения конечных концентраций 5, 10, 15%
в соотношении 1:1. Объем замораживаемого образца составлял 1 мл. Охлаждение СКИ
проводили сразу после добавления раствора криопротектора, а ФС после
предварительной
20-и минутной инкубации.
Замораживание проводили на программном замораживателе «Cryoson» (Германия) в
криоампулах («Nunс») объемом 1,8 мл. Регистрацию программы замораживания
проводили при помощи установленной в криоампулах медь-константановой термопары
и самописца «Endim» 622.01.
2.5.1. Режимы охлаждения, использовавшиеся для исследования влияния скоростей
охлаждения образцов в температурном интервале от начала охлаждения до -40°С
При исследова
- Киев+380960830922