РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Для выполнения диссертационной работы были обследованы 674 больных диареей, лечившихся в период 1995-2000 г.г. на кафедрах инфекционных болезней Харьковской медицинской академии последипломного образования МЗ Украины (зав. кафедрой - проф. В.П. Малый) и Харьковского медицинского университета (зав. кафедрой - проф. В.Н. Козько) на базе Областной клинической инфекционной больницы (главный врач - к.м.н. Н.А. Колодий).
В работе представлены результаты клинических и лабораторных исследований, охватывающие 88 больных коронавирусной инфекцией. Контрольную группу составили 48 здоровых лиц.
Среди больных коронавирусной инфекцией было 57 мужчин и 31 женщина в возрасте от 16 до 60 лет.
У всех больных проводилось изучение анамнеза заболевания, анамнеза жизни и эпидемиологического анамнеза. Особое внимание обращали на начало заболевания, появление и длительность симптомокомплексов, характеризующих поражение желудочно-кишечного тракта, интоксикацию, температурную реакцию. Исследовались наличие болевого синдрома, характер испражнений, наличие примесей, длительность диареи. Больным проводили бактериологическое, вирусологическое и серологическое обследование.
С целью изучения клинической симптоматики и проведения ее сравнительной характеристики была выделена группа больных с монокоронавирусной инфекцией (64 человек). В ее состав вошло 24 больных с легким и 40 пациентов со среднетяжелым течением вирусной диареи. Кроме того, нами выделена группа больных, состоящая из 24 человек с коронавирусной инфекцией и одновременным выделением патогенных бактерий (шигеллы, сальмонеллы, условно-патогенная флора кишечника) и вирусов. Больные со среднетяжелым течением смешанной инфекции составили 19 человек, с тяжелым - 5.
С целью выявления эффективности использования препарата "Прополтин" 73 больных коронавирусной инфекцией были разделены на две группы: 24 человека с легким течением и 49 со среднетяжелым течением болезни. Из них 14 больным с легким и 29 пациентам со среднетяжелым течением вирусной диареи назначался препарат "Прополтин" в рекомендованных дозах (инструкция по применению) 0,1 г 3 раза в день в течение 5 дней. Группа сравнения была представлена при легком течении - 10 больными, при среднетяжелом - 20 пациентами с коронавирусной инфекцией.
Вирусологические и серологические исследования инфекционного материала больных проводились на базе вирусологической лаборатории Института микробиологии и иммунологии им. И.И. Мечникова АМН Украины (заведующая проф. Л.А. Панченко).
Выявляемость маркеров коронавирусной инфекции представлена в табл.2.1.
Таблица 2.1.
Частота выявления маркеров коронавирусной инфекции у больных
Метод исследованияКоличество обследованных больныхКоличество больных с выделенными маркерамиабс.(?m) (%)РГА67423728,4±2,1РТГА (антиген)2373615,2?1,6РТГА (антитела)461516,3?3,1РВИЭФ (антиген)2103818,2?1,5ФЗ ДСМ (антиген)1122320,5?3,3ФЗ МДХИ (антиген)1122522,3?0,9
Установление этиологии острых кишечных инфекций (ОКИ) осуществляли согласно методическим рекомендациям "Лабораторная диаг-ностика коронавирусной острой кишечной инфекции" (Харьков, 1992 г.) ?87?.
Материалом для вирусологических исследований служили фекалии, собранные в первые дни болезни. Из них приготавливали 10% суспензию на растворе Хенкса, осветляли ее центрифугированием (250 (, 30 мин, 20(С), добавляли пенициллин и стрептомицин, выдерживали при +4(С не более 10-12 часов и направляли в лабораторию. Были использованы следующие методики:
1. Обнаружение коронавирусных антигена и антител с помощью РТГА.
Для осуществления РТГА проводят предварительный скрининг экстрактов фекалий, обладающих гемагглютинирующей активностью в титре 1:16 и выше в отношении 1% суспензии эритроцитов мышей. Для приготовления 1% суспензии эритроцитов, кровь от мышей берут в сосуд с 2,5% раствором лимонно-кислого натрия в соотношении 1:10, отмывают физиологическим раствором (рН 7,2) путем центрифугирования при 2000 об/мин. в течение 10-15 мин. не менее 3-х раз до получения прозрачной надосадочной жидкости. Из осадка эритроцитов готовят 1% суспензию в физиологическом растворе.
Специфичность проб с высокой гемагглютинирующей активностью определяют с помощью телячьей антисыворотки, которую предварительно истощают мышиными эритроцитами для удаления неспецифических ингибиторов агглютинации. Для этого к 1 мл разведенной 1:10 сыворотки добавляют 25 мкл (1 капля) осадка отмытых мышиных эритроцитов, выдерживают 1 час при 37?С и освобождают от эритроцитов путем центрифугирования при 2000 об/мин. в течение 10 мин.
Реакцию ставят в объеме 50 мкл в планшетах для иммунологических исследований. В первом ряду готовят серийные разведения проб фекалий на физиологическом растворе, во втором - на истощенной телячьей коронавирусной антисыворотке, разведенной 1:10.
Планшеты для контакта оставляют на 1 час при температуре +37?С, после чего во все лунки вносят 1% суспензию эритроцитов.
Учет реакции проводят через 30-40 минут после полного оседания эритроцитов в контроле (25 мкл физиологического раствора и 25 мкл 1% мышиных эритроцитов). Снижение гемагглютинирующей активности экстрактов фекалий в 4 и более раз в присутствии коронавирусной антисыворотки расценивается как диагностическое.
Для серодиагностики коронавирусной ОКИ применяется микрометод реакции торможения гемагглютинации с 1% мышиными эритроцитами.
Реакцию ставят по общепринятой методике в микропанелях аппарата Такачи.
В качестве антигена используют культурный штамм коронавируса телят, пассируемый на культуре клеток трахеи.
Перед исследованием парных сывороток больных, взятых в начале заболевания и в стадии реконвалесценции, определяют титр коронавирусного антигена и его рабочую дозу для постановки основного опыта. С этой целью в лунки планшетки с помощью микродозатора или пипетки с калиброванной насадкой вносят по 25 мкл физраствора (рН 7,2) и дела