РАЗДЕЛ 2
УСЛОВИЯ И МЕТОДИКА ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ
Исследования проводились в лаборатории биотехнологии Института овощеводства и бахчеводства Украинской академии аграрных наук в 1991-2001 гг. В работе применялись общепринятые методы биотехнологических исследований, описанные в ряде работ [152, 154, 203, 204]. Использовались рекомендации многих отечественных и зарубежных авторов по подбору питательных сред, методике стерилизации растительного материала, способам предварительной обработки зонтиков перед введением в культуру in vitro и другим частным вопросам .
Исследования по разработке методов получения гаплоидных растений лука репчатого проводили в 1993-1997 и 2000-2001 гг. В качестве исходного материала нами были использованы 24 сорта и гибрида, перечень которых, приведен в приложении В. Донорные растения выращивались в пленочных теплицах и на опытных полях ИОБ УААН.
Часть срезанных с растений зонтиков перед введением в культуру in vitro была подвергнута предварительной обработке двумя факторами:
а) низкими положительными температурами (+4 0С) в течение 1-6 дней;
б) раствором 2,4-Д (2 мг/л) на протяжение 1-6 дней.
Цель этой предобработки заключалась в повышении эффективности получения гаплоидных растений.
Стерилизация растительного материала для введения в культуру in vitro осуществлялась в ламинарном боксе марки БП-4-004. Зонтики обрабатывали 7 сек. 70 % этанолом, затем дезинфицировали в 0,1 % растворе дегмина 12 мин. После стерилизации материал отмывали 3 раза в стерильном дистилляте. Для получения гаплоидов путем андрогенеза мы использовали бутоны, находящиеся в одноядерной стадии развития. Для этого с маточников лука репчатого отбирали соцветия диаметром 2,0 - 3,0 см с закрытыми обертками. Для уточнения стадии развития пыльцевых зерен с зонтиков отбирались бутоны определенного размера. С этих бутонов стерильным скальпелем отбирали пыльники. Среды пыльников окрашивали ацетокармином по методике, описанной З.П.Паушевой [205]. Стадию развития пыльников устанавливали под микроскопом.
После определения стадии развития пыльцевых зерен и связи ее с размером бутонов отбирали бутоны нужного размера. С помощью пинцета пыльники отбирали из бутонов и по 10 штук высаживали на агаризованные питательные среды. В опытах было изучено 89 вариантов питательных сред, полный список которых приводятся в приложении Д.
Высаженные пыльники культивировались при температуре 25-270С в условиях 16-часового фотопериода (при освещенности 1 тысяча люксов) и в темноте.
Часть материала после высадки выдерживали в течение трех суток в термостате при температуре 320 С.
При появлении новообразованных структур на пыльниках пыльники пересаживали на безгормональную питательную среду МС, дополненную витаминами и сахарами (вар. А4, табл. 3.5). Культивирование их проводилось при температуре 24-270 С и 16-часовом фотопериоде (освещенность 5 тысяч люксов).
В опытах по получению гаплоидов путем гиногенеза нами изучалась возможность использования для этих целей трех различных донорных органов:
неоплодотворенных семяпочек, неоплодотворенных завязей и бутонов в двухэтапной системе регенерации (бутон-завязь).
Для введения в культуру in vitro использовали бутоны: 1) размером 3 мм; 2) размером 4 мм; 3) с начавшими расходиться лепестками. Бутоны стерилизовали 70 % спиртом, а затем 0,1 % раствором дегмина (12 мин). После стерилизации бутоны 3 раза отмывали в стерильном дистилляте. Завязи и семяпочки вырезали из бутонов различного размера под бинокулярным микроскопом МБС-10 с помощью дисцизионной иглы.
Экспланты пинцетом высаживали в пенициллиновые пузырьки (по 4-10 штук в каждый) на поверхность твердых питательных сред различного состава. Всего в опытах по гиногенезу нами было изучено 108 вариантов питательных сред (см. приложение Д).
В диссертации же приводятся данные только по вариантам, представляющим наибольший интерес.
Учитывая сложность установления стадии развития зародышевого мешка у донорных завязей лука репчатого, мы проводили фиксацию пыльников с использованных для гиногенеза бутонов. Фиксация пыльников осуществлялась в уксусном алкоголе. Для установления стадии развития пыльцевых зерен проводилось окрашивание их ацетокармином по З.П.Паушевой [205] и просмотр под микроскопом. Экспланты культивировали 1-3 месяца при температуре 18-270С при 16 часовом фотопериоде (освещенность 2 тысячи люксов и 5 тысяч люксов) и в темноте.
При изучении возможности применения для индукции гиногенеза двухэтапной системы регенерации растений на среду для индукции (вар. А2, табл.3.5) высаживали простерилизованные бутоны. Бутоны размещали на поверхности агаризованной питательной среды в чашках Петри (по 20 штук в каждой чашке).
Растительный материал культивировали при температуре 20-270С и 16 часовом фотопериоде (освещенность 2000 люксов). Через 6 дней культивирования из раскрывшихся цветков стерильным скальпелем были вырезаны завязи, которые высаживались на твердые питательные среды для регенерации (вар. А5). При появлении новообразованных структур в культуре семяпочек и завязей такие экспланты пересаживали на твердую безгормональную питательную среду 1/2 МС (вар. А4, табл.3.5), или дополненную 0,5 мг/л ИМК среду 1/2 МС .
Подращивание полученных новообразованных побегов осуществлялось в течение четырех-пяти пассажей. При сформировании у растений-регенерантов луковичек диаметром более 3 мм проводилось дополнительное микроклональное размножение in vitro полученного материала. В ламинарном боксе регенеранты извлекались из пробирок и скальпелем разрезались вдоль оси растения на две равные части. Экспланты высаживались на поверхность твердой питательной среды БДС, дополненной БАП (4 мг/л) и НУК (4 мг/л), витаминами и сахарозой (45 г/л). Более подробно процедура микроклонального размножения меристематических тканей лука репчатого описана ниже.
Цитологический анализ полученных растений-регенерантов выполнялся путем подсчета