Ви є тут

Клініко-генетичні дослідження та роль цитокінової регуляторної мережі в патогенезі гострого вірусного гепатиту В.

Автор: 
Лядова Тетяна Іванівна
Тип роботи: 
Дис. канд. наук
Рік: 
2005
Артикул:
0405U000474
129 грн
Додати в кошик

Вміст

РОЗДІЛ 2
ОБґЄКТ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Методи дослідження
Нами було обстежено 163 хворих (84 чоловіка і 79 жінок) з діагнозом ГВГВ. Усім
хворим було проведено комплексне клінічне обстеження з урахуванням
клініко-анамнестичних даних, епідеміологічного анамнезу, анамнезу захворювання,
додаткових лабораторних та інструментальних методів дослідження. Крім того,
обстежено 20 практично здорових осіб, які склали порівняльну групу.
Матеріалом для дослідження була сироватка крові хворих на ГВГВ, отримана в
період розпалу захворювання (І період) і в період реконвалесценції (ІІ
період).
Кров для дослідження брали із ліктьової вени натще у спеціальну стерильну
пробірку із антикоагулянтом (розчин гепарину 0,1 мл) у кількості 10 мл. Після
інкубації та центрифугування отримували сироватку, яку розливали у пробірки
типу “Епендорф” по 1,5 мл. Зберігали зразки при -600С. Допускалося тільки
одноразове розмороження сироватки безпосередньо перед використанням.
Із загальноприйнятих біохімічних тестів у динаміці захворювання були
використані вміст білірубіну і його фракцій методoм L. Jendrassik, P. Grof
[171], активність аланінамінотрансферази (АлАТ) у сироватці крові визначали
уніфікованим методом S. Reitman, S. Frankel [202], тимолову пробу – методом J.
Huerga, H. Popper та сулемову пробу – методом F. Grinstedt [77]. У більшості
хворих досліджувався рівень загального білка в сироватці крові мікробіуретовим
методом G. Kingsley [174], а також білкові фракції турбодиметричним методом
[77]. Як норму біохімічних показників використовували загальноприйняті
значення. Біохімічні показники виражалися у Міжнародній системі одиниць СІ, яка
затверджена у 1978 р. Стандартом РЕВ 1852-78 "Метрологія. Одиниці фізичних
величин".
У всіх хворих діагноз ГВГВ підтверджувався виявленням у сироватці специфічних
серологічних маркерів ГВ (HBsAg, анти-HBc, анти-HBc IgM, HBeAg, анти-НВе)
методом імуноферментного аналізу (ІФА) за допомогою тест-систем НВО
"Диагностические системы" (Росія).
Молекулярно-біологічні дослідження включали визначення реплікативної активності
НВV на підставі виявлення в сироватці крові ДНК НВV методом ПЛР із
використанням праймерів, компліментарних консервативній ділянці S-гена.
Генотипування проводили методом аналізу поліморфізму довжин рестрікційних
фрагментів за методом М. Мizokami із співавт. [189] у модифікації ЦНДІЕ м.
Москви.
Продукти ПЛР оброблялися генотипоспецифічними ендонуклеазами рестрикції.
Проводилося приготування реакційної суміші на 15 реакцій: у пробірку 0,5 мл
вносили 30 мкл 10х ендонуклеазного буферу, 30 мкл ВSA (концентрація 1 мкг/мл) і
додавали 15 мкл ферменту (концентрація 5 од/мкл). Перемішували на вортексі,
розкапували у мікропробірки по 5 мкл реакційної суміші. У кожну пробірку, яка
мала реакційну суміш, додавали певну кількість ампліфіконів (специфічних
фрагментів ДНК вірусу ГВ).
Виключення мікст-гепатитів здійснювалося на підставі негативних результатів
індикації серологічних маркерів гепатитів А і С (анти-НАV Ig M, анти-НСV
(сум.)) методом ІФА.
Для дослідження сироваткового рівня ІЛ-1в, ФНП-б, ІЛ-6, ІЛ-2, ІЛ-4
використовували тест-системи ООО “Протеиновый контур” (Санкт-Петербург, Росія),
користуючись інструкцією виробника. В даних тест-системах використовується
твердофазний імуноферментний метод із застосуванням пероксидази хрону як
індикаторного ферменту. Один тип антитіл імобілізується на внутрішніх поверхнях
планшетів для мікротитрування. Інший тип моноклональних антитіл до незалежного
епітопу молекули інтерлейкіна знаходяться у наборі у вигляді кон'югата з
біотином. Індикаторним компонентом є кон'югат пероксидази хрону зі
стрептавідином, що має дуже високу спорідненість з біотином. Після інкубації і
промивання в лунки вносять кон'югат пероксидази зі стрептавідином, знову
інкубують, промивають, вносять субстрат і вимірюють активність зв'язаної
пероксидази з використанням автоматичного фотометра для мікропланшетів.
Дослідження проводилось з використанням безпосередньо нерозчинених зразків
сироватки крові людини. Нерозбавлені зразки розморожували дуже швидко за
допомогою теплової обробки на водяній бані при температурі 370С, щоб запобігти
осадженню фібриногену.
До початку роботи всі реагенти необхідно було довести до кімнатної температури
і приготувати потрібну кількість буферних розчинів. Для цього розчиняли
концентрати у відповідному співвідношенні дистильованою водою. Розкривали пакет
із планшетом і відбирали необхідну кількість стрипів. Двічі промивали лунки,
додаючи по 300 мкл буферу для промивання в кожну лунку і проводячи повну
аспірацію рідини.
Розбавляли 1:40 необхідну для аналізу кількість кон'югата з розрахунку 3,2 мл
готового розчину на 1 здвоєний стрип, добре перемішували отриманий розчин,
після чого розчинили вміст ампул зі стандартними препаратами, вносячи по 1мл
буферу С для зразків у кожну лунку.
В лунки планшету А1-D1 вносили по 200 мкл стандартів інтерлейкіну, в осередок
Е1 внесли по 200 мкл буфера С (стандарт 0), і в лунки мікропланшету, що
залишилися, вносили досліджувані зразки в об'ємі 200 мкл. Після цього
інкубували 1годину при +370С.
Видаляли рідину з лунок, тричі промивали їх буфером В (300 мкл на одну лунку) і
двічі - дистильованою водою. Проводили повну аспірацію рідини, що залишилася.
Розбавляли 1:40 необхідну для аналізу кількість кон'югата стрептавідину із
пероксидазою хрону буфером С і вносили по 200 мкл розчину в кожну лунку
мікропланшета й інкубували 30 хв при кімнатній температурі і безупинному
струшуванні. Далі змішували в рівних співвідношеннях розчини з маркіруванням