СОДЕРЖАНИЕ
СОДЕРЖАНИЕ.................................................................2
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ..........................................................4
ВВЕДЕНИЕ...................................................................5
Актуальность темы........................................................5
Цель и задачи исследования...............................................7
Научная новизна..........................................................7
Практическая значимость работы...........................................8
Апробация работы.........................................................8
Объем и структура диссертации............................................9
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.........................................................10
1. Характеристика возбудителя..........................................10
1.1. Систематика и классификация.......................................10
1.2. Морфологические, культуральные и ферментативные свойства эшерихий 12
1.3. Антигенные свойства эшерихий..............................................................................13.
2. Факторы патогенности энтерогеморрагических эшерихий и их роль в"
ПАТОГЕНЕЗЕ........................................................... 14
2.1. КОЛО! ШЗАЦИЯ КИШЕЧНИКА ЭГКП....................................... 15
2.2. ШИГАПОДОБНЫЕ ВЕРОЦИТОТОКСИНЫ.................................... *16
2.2.1. Номенклатура шигатоксииов...................................... 16'
2.2.2. Биологические свойства шигатоксииов.............................19
2.2.3. Строение шигатоксииов и их патогенетическое действие............20
3. Эпидемиология и эпизоотология возбудителя.......................... 2Ц
4. Экология энтерогеморрагических эшерихий..................К:/.........27
5. Методы выделения и идентификации энтерогеморрагических эшерихий 29
6. Принцип полимеразной цепной реакции.................................34
7. Заключение..........................................................39
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.................................................41
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.......................................................41
1. Штаммы микроорганизмов, использованные в работе......................41
2. Культивирование бактерий и определение концентрации..................42
3. Клинический материал и его подготовка................................43
4. Методика выделения геномной ДНК из исследуемого материала методом
ПРОТЕИ НАЗНОЙ ОБРАБОТКИ И ОСАЖДЕНИЯ ЭТАНОЛОМ С ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЙ ФЕНОЛЬНОЙ ЭКСТРАКЦИЕЙ............................................44
5. Методика выделения геномной ДНК из исследуемого материала методом АФФИННОЙ СОРБЦИИ ДНК НА СИЛИКАГЕЛЕ..................................44
6. Методика проведения реакции амплификации.............................46
6.1 Состав реакционной смеси, условия амплификщпи......................46
6.2 «Горячий старт»....................................................47
7. Методика проведения электрофореза в агарозном геле...................47
8. Клонирование фрагментов ПЦР в фаг А.сг10.............................48
8.1 ОчистюI фрагментов ПЦР.............................................48
8.2 Рестрикция фрагмента ПЦР............................................48
8.3 Гель-электрофорез, элюция фрагмента из геля.........................49
8.4 Реакция лигирования.................................................49
8.5 Упаковка фаговых частиц.............................................49
8.6 Приготовление клеток Е. сои.........................................50
8.7 Высев упакованных частиц фага.......................................50
8.8 Отбор клонов и элюция фаговых частиц................................50
8.9 Наращивание рекомбинантных фаговых частиц...........................50
9. Секвенирование.......................................................51
9.1 Подготовка матрицы ДИК - очистка продуктов ПЦР.....................51
9.2 Измерение концентрации ДНК на флюориметре...........................52
9.3 Секвенирующая амплификация..........................................53
9.4 Очистюі от невстроившнхся ддНТФ.....................................55
9.5 Детекция продуктов секвенпрования...................................55
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ...................................................57
1. Выбор олигонуклеотидиых праймеров и изучение их специфичности ......57
2. Подбор условий ПЦР..........................................’........59
2.1. Выбор оптимальном концентрации ионов Л/<г+.........................59
2.2. Оптимизация температуры отжига праймеров...........................60
2.3. Подбор концентрации праймеров.......................•..............61
2.4. Применение «горячего старта».......................................64
3. Подбор методов выделения (очистки) ДНК............................. 65
4. Внутренний контрольный образец (ВКО).................................66
5. Отрицательные и положительные контрольные образцы....................66
6. Состав разработанной тест-системы....................................67
7. Определение аналитической специфичности и чувствительности тест-системы ............................................................69
8. Исследование фекалий от животных с помощью тест-системы «КОЛИ-ДИФ» . 72
9. Комиссионные испытания ПЦР-тест-системы «КОЛИ-ДИФ»...................73
10. Изучение активности и стабильности ПЦР-тест-системы в зависимости от срока хранения......................................................75
11. Использование тест-системы «КОЛИ-ДИФ» для государственного контроля пищевой продукции и кормов..........................................75
ОБСУЖДЕНИЕ.........................................................і.....77
ВЫВОДЫ..........................:...............”.........................83
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ..................................................84
ЛИТЕРАТУРА................................................................85
ПРИЛОЖЕНИЯ...............................................................104
3
- Научно-проблемных методических комиссиях ФГУ «ВГНКИ»
(2004-2007 гг.).
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 104 страницах компьютерного текста (текстовый редактор «Microsoft Word 2003»), и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов исследований, выводы, практические предложения. Диссертация иллюстрирована 11 рисунками и 12 таблицами. Приложение к диссертации содержит разработанную нормативную документацию, подтверждающую результаты исследований, их научно-практическую ценность. Список литературы включает 162 источника, в том числе 127 иностранных.
9
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Характеристика возбудителя
1.1. Систематика и классификация
Escherichia coli - бактерии, принадлежащие к семейству Enterobacteriaceae, роду Escherichia, впервые выделены и описаны Т. Эшерихом в 1885 г и впоследствии названы им Bacterivm coli commune. Однако уже в конце XIX века было выяснено, что открытый Т. Эитерихом микроорганизм является одним из представителей целого семейства кишечных бактерий, объединявшего множество сходных между собой видов.
Микроорганизмы, принадлежащие к семейству Enterobacteriaceae многочисленны и разнообразны по морфологии, ферментативным и
культуральным свойствам, антигенной структуре, отношению к
бактериофагам, колицинам, антибиотико- и химиотерапевтическим
средствам, их классификация и номенклатура многократно подвергались и подвергаются ревизии, дополнениям и изменениям (3,4, 7, 11, 35).
Семейство кишечных бактерий состоит из взаимосвязанных
бактериальных типов, не поддающихся четкому разграничению на трибы и роды. Переход одного рода к другому происходит постепенно и между родами имеются промежуточные штаммы. Однако, это семейство настолько многообразно, что вызвало необходимость разделения его на роды для удобства классификации.
Современная классификация семейства Enterobacteriaceae основана на совокупности морфологических, физиологических и ферментативных свойств бактерий и отчасти генетическом анализе (9. 35).
Согласно “Определителю бактерий «Берджи» энтеробактерии разделены на 14 общеизвестных и 6 малоизвестных или недавно
ю
- Київ+380960830922