РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Об'єм дослідження
Робота проведена на базі дитячої клінічної лікарні м. Тернополя і базується на результатах клінічного, інструментального і лабораторного обстеження 110 дітей із хронічним гастродуоденітом у віці від 6 до 15 років.
Були застосовані наступні методи дослідження: клініко-анамнестичний, з використанням спеціально розробленої карти-схеми опитування, ЕФГДС із прицільною біопсією СО фундального і антрального відділів шлунка і ДПК для виготовлення гістологічних препаратів, проведення уреазного експрес-теста для виявлення НР, цитологічний метод із виготовленням мазка-відбитка біоптату, дослідження кислотоутворюючої функції шлунка методом інтрагастральної рН-метрії.
Вивчені показники клітинного і гуморального імунітету: Е - РУК, ЕА - РУК, нульові клітини, Тр - РУК (Тх) і Тч - РУК (Тс), хелперносупресорний індекс, ЕАС - РУК, Ig A, M, G, ЦІК, Сн50. Простежена динаміка локальних імунних реакцій в СОШ обстежених дітей із визначенням плазматичних клітин - продуцентів Ig А, M, G та SIg А.
2.2. Ендоскопічне дослідження шлунка і ДПК
Для верифікації діагнозу проводилася ЕФГДС ВВТТ із використанням гнучкого ендоскопа GIF типу PQ 20 "Olympus" (Японія). Ендоскопічне обстеження проводилося натще, в положенні лежачи на лівому боці по загальноприйнятій методиці. Для оцінки змін СОШ використовувалися ендоскопічна класифікація Мазурина А.В. [183] та Сіднейська класифікація (1990), у відповідності до яких виділялися наступні ендоскопічні форми ураження СОШ:
1. Поверхневий гастрит ( еритематозний, ексудативний)
2. Ерозивний гастрит
3. Геморагічний гастрит
4. Атрофічний ( гіпотрофічний) гастрит
5. Змішаний гастрит
6. Гіпертрофічний ( гіперпластичний) гастрит.
Ендоскопічне дослідження супроводжувалося прицільною біопсією СО тіла, антрального відділу шлунка і ДПК з послідуючим виготовленням гістологічних препаратів, вивченням морфологічної картини і виявленням НР.
Для оцінки змін СО ДПК при ХГД, асоційованому з НР, розрізняли наступні ендоскопічні форми дуоденіту: поверхневий, виражений, різко виражений, атрофічний (гіпотрофічний) та ерозивний [183].
2.3. Морфологічне дослідження СОШ та ДПК
При біопсії брали по одному фрагменту із кожного відділу, потім частину біоптатів фіксували в 10 % розчині нейтрального формаліну, після відповідного проведення через етиловий спирт зростаючих концентрацій заливали парафіном; парафінові зрізи товщиною 5 мкм -7 мкм забарвлювали гематоксиліном і еозином, за ван Гізон. Оцінку препарату проводили під світловим мікроскопом при малому, в 140 разів, та при великому, в 630 разів, збільшенні. Виявлення НР у поєднанні з гастритичними змінами СО свідчило про наявність гастриту, асоційованого з HР. З метою ідентифікації НР в біопсійному матеріалі використовували фарбування препаратів за методом Гімзи, при цьому НР забарвлювався в темно-синій колір і приймав вигляд прямих або дещо зігнутих паличок. Ступінь інвазії НР у СОШ і ДПК визначали за методом Л.І.Аруіна: до 20 мікробних тіл у полі зору мікроскопу - 1-ий, або легкий,ступінь обсіювання (+), від 20 до 50 мікробних тіл - 2-ий, або середній, ступінь (++), більше 50 мікробних тіл - 3-ий, або тяжкий ступінь (+++) [8].
При морфометричному дослідженні СОШ за допомогою окулярного мікрометра вимірювали висоту поверхневого епітелію. За допомогою морфометричної сітки визначали об'ємну долю залоз, залозисто - стромальний індекс і площу епітелію залози на 100 мкм2. Об'ємна доля залоз (%) являє собою відношення сумарної площі всіх залоз, що знаходяться в полі зору до площі даного поля зору. Залозисто - стромальний індекс вираховували відношенням сумарної площі залоз до площі строми. При морфометрії СО ДПК вимірювали висоту і ширину ворсинок, висоту епітелію ворсинок, глибину і ширину крипт. Індекс ворсинок вираховували відношенням висоти ворсинок до глибини крипт.
При оцінці морфологічних змін СОШ також користувалися Сіднейською класифікацією гастритів, при цьому виділяли наступні морфологічні форми гастритів:
1. Неатрофічний ( поверхневий) гастрит
2. Гастрит з ураженням залоз без атрофії
3. Помірно виражений атрофічний гастрит
4. Атрофічний гастрит.
Морфологічно виділялися п'ять основних ознак, характерних для хронічного гастрита: запалення, активність, атрофія, кишкова метаплазія, ступінь обсіювання слизової оболонки НР. Вираженість запалення характеризувалася кількістю запальних клітин (лімфоцитів, плазмоцитів), які виявлені у власній пластинці СОШ. Атрофія визначалася втратою шлункових залоз. Про ступінь активності запалення свідчила нейтрофільна інфільтрація власної пластинки та міжепітеліальних просторів СОШ.
Згідно змін морофологічної картини СО ДПК у дітей з ХГД, асоційованим з НР, виділяли наступні гістологічні форми дуоденіту: поверхневий, дифузний (без атрофії залоз) та атрофічний [37].
2.4. Уреазний тест
Уреазний тест базується на унікальній властивості бактерій за рахунок ферменту уреази розкладати сечовину до двуокису вуглецю і аміака, змінюючи рН середовища в лужну сторону. Для його проведення частина дітей була обстежена за допомогою комерційного де-нол - тесту ( фірми "Yamanouchi", Японія-Нідерланди), при цьому результати отримували від 5-20 хвилин до 1 години. Поява малинового кольору протягом перших 20 хвилин свідчила про значну інфікованість слизової оболонки НР (+++), наступних 20 хвилин- помірну (++), пізніше - незначну (+). Якщо колір змінювався в більш пізні терміни - результат вважався негативним. Оскільки комерційний експрес-тест не був доступний в достатній кількості, то для подальшої роботи використовували середовище Закса [156]. Принцип уреазного тесту відображено на наступному рисунку 2.1 [132]:
NH2
NH2 C = О + 2Н2О + Н 2NH4+ + HCO3-